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1、植物基因组提取 实验汇报,汇报内容,实验原理 实验流程 实验结果 结果分析 实验总结,实验原理,植物DNA的制备，必须首先注意植物细胞与动物及细菌细胞的不同： 植物组织含有坚硬的纤维素，采用温和条件难以破碎细胞； 植物细胞一般具有大的液泡，破碎细胞时有机酸随之逸出将使pH显著下降； 通常植物细胞的DNA含量较低； 植物中含有大量多糖、脂质、色素和酚类等物质。,实验原理,提取植物DNA的主要程序包括： 破碎细胞壁，释放细胞内含物； 破细胞膜及核膜使DNA释放到提取液中； 除去DNA粗提液中含有的RNA、蛋白质、多糖、丹宁及色素等杂质。,实验原理,本实验中采用CTAB法提取DNA。 CTAB与核酸
2、形成的复合物在高盐溶液中是可溶的，当溶液盐的浓度降低到一定的程度时，它将从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与DNA的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将此复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀。因CTAB能溶于乙醇，离心后即可得DNA沉淀。,实验原理,DNA浓度（g/mL）=（OD260nm/0.020L）稀释倍数 式中：OD260nm为吸光度L为比色皿光径，单位cm0.020为1g/mLDNA钠盐的光密度,实验流程,称取样品 液氮研磨 加入CTAB水浴保温 氯仿/异戊醇 氯仿/异戊醇 95%乙醇 加有RNase的TE缓冲液 氯仿/异戊醇 95%乙醇 TE溶解 NaAc和95%乙醇
3、测定吸光度和琼脂糖凝胶电泳,实验流程,电泳加样量如下表所示。,实验结果,第一次加入氯仿/异戊醇后，溶液由绿色变为白绿色，溶液中有绿色颗粒状固体。,实验结果,离心后，溶液分为3层，上层为亮黄色透明液体，中层为绿色块状固体，下层为深绿色液体。,实验结果,第2次加入氯仿/异戊醇后，溶液分为3层，上层为黄色透明液体，中层为橙色透明液体，下层为淡黄色泡状液体。,实验结果,离心后，溶液分为2层，上层为黄色透明液体，下层为无色透明液体。,实验结果,加入95%乙醇后，随着搅拌，溶液由澄清变浑浊，有白色絮状物出现，并随着搅拌逐渐缠绕在玻璃榜上。,实验结果,电泳结果如下图所示，条带不够清晰并有拖尾现象。,结果分析
4、,在加入氯仿/异戊醇后，溶液由绿色变为白绿色，这是因为氯仿是非极性分子，水是极性分子，当溶液与氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子被氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。由于溶液中有变性蛋白质析出，因而由绿色变为白绿色。溶液中的绿色颗粒是研磨时未完全破碎的植物组织。,结果分析,经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面。而氯仿比重更大，保留在最下层。,结果分析,在用氯仿/异戊醇处理2遍之后，中层溶液较少，说明此时溶液中含有的变性蛋白质较少，进而说明溶液中的蛋白质基本除净。,结果分析,吸光度测定结果如下表所示。,结果分析,由图可见，各条带颜色较浅，这可能是由于： 加样
5、量偏少； 加样过程中有样品从孔中溢出，而造成样品的损失； 提取的样品中DNA含量偏低。,结果分析,由图可见，各条带均有拖尾现象。这可能是由于： 提取过程中DNA发生了降解； 提取过程中由于机械损伤使DNA片段断裂； 提取的DNA纯度不高，含有蛋白质、多糖等杂质； DNA样品受到了外源DNA的污染； 电泳条件没有控制好； 配置的胶的浓度不合适。,实验总结,各试剂的作用 实验过程总结,试剂作用,Tris-HCl(pH8.0)提供的pH环境可防止核酸被酸水解。 EDTA螯合Mg2+和Mn2+可抑制DNase的活性。,试剂作用,巯基乙醇能防止酚类氧化，使酚类容易除去。 NaAc和乙醇用于沉淀DNA。1
6、/10体积的NaAc和两倍样品体积的乙醇可有效沉淀DNA 。 RNase用于选择性的降解RNA。,试剂作用,氯仿可以使蛋白失去水合状态而变性。 在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇也有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,实验总结,在用液氮研磨时，要保证叶片始终处于冷冻状态，以减少叶片组织中含有的DNase对DNA的降解。 95%的乙醇最好预先冷却，这样对DNA的析出比较有利。 步骤的重复尽量减少，以减少DNA的损失。,实验总结,实验过程中要尽量避免外源DNA对样品的污染。 在离心之后，应尽量将不用的液层除净，以避免对之后的步骤产生影响。 溶解DNA时所用TE的量应尽可能的少，以保证溶液中DNA的浓度不会太低。,实验总结,电泳时，尽量避免向靠近边缘的点样孔加样，以避免边缘效应对条带产生影响。 点样时尽量避免样品从点样孔中溢出，而造成样品的损失。,Thank you!,
