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1、白介素-18 促动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡的作用来源：创新医学网 作者：李巧汶,李志梁,邱健 1作者单位：1 广州市广州军区总医院心内科(南方医科大学珠江医院心内科，广东 广州 510282)【摘要】 目的 探索白介素-18(IL-18)促进动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡的作用及其机制。方法 采用 30 只老年同龄雄性动脉粥样硬化模型新西兰大白兔制成 60 个动脉粥样硬化板块标本，采用析因设计，给予 IL-18 进行刺激，以不同的 IL-18 刺激时间和刺激浓度组合作为新处理组，将 60 个动脉粥样硬化斑块标本随机分入新处理组中(n=5)，测量在不同刺激时间和刺激浓度下，纤维帽的厚度与脂核横截面厚
2、度的变化，TUNEL 法检测斑块内细胞凋亡的改变。结果 帽/核比值与斑块内细胞凋亡指数随着 IL-18 的浓度及刺激天数的改变而变化(P0.01)。帽/核比值随着 IL-18 的浓度及刺激天数增加而降低(P0.01)，斑块内细胞凋亡指数随着 IL-18 的浓度及刺激天数增加而升高 (P0.01);斑块内细胞的凋亡指数与帽/核比值呈显着线性负相关(r=-0.776，P0.001)。 结论 IL-18 诱导斑块内细胞凋亡可能是其促易损斑块形成的重要机制。【关键词】 IL-18;动脉粥样硬化;细胞凋亡; 易损斑块【Abstract】 Objective To explore the role and
3、 mechanism of interleukin-18 (IL-18) in promoting apoptosis of cells in atherosclerotic plaques.Methods 30 male New Zealand white rabbits were selected and euthanized.The entire length of the aorta was exposed and divided into several segments.Histological assessment of experimental atherosclerosis
4、was evaluated.Rabbits in experimental group were received stimulation of IL-18.New group was established according to work time and concentration of IL-18，the 60 specimens were randomly divided into the new treatment group (n= 5)，the thickness of fibrous cap and nuclear cross section were measured a
5、fter stimulation of IL-18.At last，apoptosis was detected by TUNEL.Results The cap/core ratio and apoptotic index of plaques were changed according to the concentration and work time of IL-18|(P0.01)，with the concentration and work time of IL-18 increased，the cap/core ratio of plaques reduced (P0.01)
6、 and apoptotic index of plaques raised inversely (P0.01)，apoptotic index of cell in plaques was significantly negatively correlated with the cap/core ratio(r=-0.776，P0.001).Conclusions IL-18 inducing apoptosis in plaque may be the main mechanisms of promoting the formation of vulnerable plaque.【Key
7、words】 Interleukin-18;Atherosclerosis;Apoptosis;Vulnerable plaque目前认为，易损斑块(VP)溃疡、破裂、血栓形成是急性冠脉综合征(ACS)发生的主要病理生理过程。炎症是 VP 形成的最重要的机制之一，白介素-18(IL-18)作为在炎症反应系统中发挥中心性作用的炎症因子，不但与动脉粥样硬化(AS)斑块的发生、发展1，2，且参可能与 VP 的形成1，3，但 IL-18 促 VP 形成的机制尚不清楚。研究表明4，5，IL-18 可诱导多种细胞发生凋亡，而斑块内细胞凋亡是 VP 的重要特征之一。由此推测 IL-18 可能通过诱导斑块内细
8、胞凋亡促进 VP 的形成，但相关的证据缺乏。本研究通过 IL-18 刺激离体 AS 斑块，观察斑块内的细胞凋亡指数及形态特征，旨在探索 IL-18 促进 VP 形成的可能机制。1 材料与方法1.1 动脉粥样硬化模型的制备30 只老年健康雄性新西兰白兔，均为 3 月龄,平均体重 2.2 kg，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号 0055273。新西兰白兔予适应性喂养 1 w 后给予高脂饲料(内含 1.5 %的胆固醇、5%猪油和0.5%的胆盐) 10 w，食物和水根据动物的需求供给。10 w 后，注射过量的戊巴比妥处死动物。解剖动物,暴露动物的腹主动脉,清除附着于动脉上的脂肪与组织，根据斑块的
9、分布把腹主动脉切割成 60 个血管块，上述操作严格遵守无菌操作的原则。1.2 离体标本分组及处理采用析因设计，给予 2 种处理因素(4 种刺激时间和 3 种刺激浓度) ，以刺激时间和刺激浓度的不同组合作为新处理组，将 60 个动脉粥样硬化斑块标本随机分入新处理组中(n=5)。把标本孵育在含血清的 Hams F10 培养基，实验组除培养基外分别加入 250、50 g/L 两种浓度的兔 IL-18 分别刺激 0、1 d、4 d、7 d;对照组孵育在含血清的 Hams F10 培养基 0、1 d、4 d、7 d。所有标本待培养基颜色变为橙黄色时更换培养基，上述操作严格遵守无菌操作的原则。1.3 标本
10、大体染色及组织学特点的测量经上述处理后，甲醛固定标本,常规石蜡包埋、切片,组织 HE 染色。使用 Image-Pro Plus 图像分析软件采集分析图像,每个斑块至少取 10 处测量纤维帽厚度取平均值,测量处包括最厚与最薄处,测量每个斑块纤维帽厚度与脂核横截面厚度的比值。1.4 斑块细胞凋亡检测采用原位凋亡试剂盒 TUNEL 法检测。每张切片随机观察 5 个高倍视野(400)，共计数 300 个细胞,计算 TUNEL 染色阳性的细胞所占百分比(凋亡指数)。1.5 统计学方法采用 SPSS16.0 统计软件进行统计分析,用 xs 表示，析因方差分析多因素各组数据间均数的差异，线性相关分析法分析两
11、个变量间的相关性。2 结 果2.1 不同 IL-18 刺激时间和浓度斑块内细胞凋亡指数的变化AS 斑块内的细胞凋亡指数随 IL-18 刺激的时间和浓度的改变而变化(P0.01) 。随着 IL-18 刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势(P0.01)。见表 1，图 1。2.2 不同 IL-18 刺激时间和浓度斑块帽/核比值的变化AS 斑块的帽/核比值随 IL-18 刺激的时间和浓度的改变而变化(P0.01) 。随着 IL-18 刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块的帽/核比值有下降趋势(P0.01)。见表 2。2.3 斑块细胞的凋亡指数与帽/核比值的相关性分析对斑块细胞
12、的凋亡指数与帽/核比值进行线性相关性分析，结果显示，斑块细胞的凋亡指数与帽/核比值呈显着线性负相关(r=-0.776，P0.001)。表 1 不同 IL-18 刺激时间和浓度斑块内细胞凋亡指数的变化表 2 不同 IL-18 刺激时间和浓度时斑块帽/核比值的变化图 1 不同斑块中的凋亡细胞(箭头所示，400)3 讨 论ACS 是以冠状 AS 斑块侵蚀或破裂继发的完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征,包括不稳定型心绞痛、ST 段抬高型心肌梗死、非 ST 段抬高型心肌梗死。一般认为，引起 ACS发生的主要病理生理过程为 VP 的溃疡、破裂、血栓的形成。炎症反应与 VP 的形成密切相关
13、，炎症可通过斑块内的炎症细胞及其分泌的促炎症因子使斑块的纤维帽变薄、脂核变大，导致 VP 表型的形成。IL-18 是一种新近发现的在炎症反应中发挥重要作用的促炎症介质，研究表明13，IL-18 参与了AS 斑块的形成、进展乃至 VP 形成的整个过程。临床资料也 6显示，ACS 患者血浆 IL-18 的水平显着升高，提示 IL-18 与 VP 的发生发展密切相关。然而， IL-18 促 VP 发生发展的机制目前尚不清楚，本研究通过 IL-18 对离体 AS 斑块的刺激，观察 IL-18 对 AS 斑块内细胞凋亡指数以及 AS 斑块形态特征的影响，以探索 IL-18 促 VP 发生发展的可能机制。
14、本研究结果显示，AS 斑块内的细胞凋亡指数随 IL-18 刺激的时间和浓度的改变而变化，随着 IL-18 刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势。AS 斑块内细胞凋亡增加可增大斑块内的坏死中心，促使纤维帽变薄，导致 VP 表型的形成，因此，斑块内细胞凋亡是 VP 的主要特征之一。本研究结果提示，IL-18 可能通过诱导斑块内的细胞凋亡促进 VP 的形成。IL-18 诱导斑块内细胞凋亡的可能途径包括：IL-18 能通过刺激机体释放多种促炎症介质(TNF、IL-1、IL-6、iNOS)诱导细胞凋亡5。IL-18 本身可直接激活外源性凋亡通路和内源性线粒体凋亡通路，诱导细胞凋
15、亡。IL-18 一方面可通过诱导 TNF 的产生、上调 NK 细胞和 Th1 细胞的 Fas-L 表达、增强的Fas-L 型介导的细胞毒活性激活外源性凋亡通路7，8，另一方面，IL-18 还可促进线粒体释放细胞色素 C 从线粒体进入细胞质而激活内源性线粒体凋亡通路9。从 AS 斑块标本的形态特征进行分析，结果表明，AS 斑块的帽/核比值随 IL-18 刺激的时间和浓度的改变而变化，随着 IL-18 刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块的帽/核比值有下降趋势，引起斑块趋于 VP 的形态特征。另外，斑块内细胞的凋亡指数与帽/核比值的线性相关性分析显示，斑块内细胞的凋亡指数与帽/核比值呈显着线性负相
16、关，提示斑块内的凋亡细胞增加促进 VP 形态特征的形成。斑块内的细胞凋亡增加导致 VP 形成的可能机制包括： 细胞凋亡后，一方面可释放胆固醇，使 AS斑块核心形成、扩大，损伤纤维帽，另一方面，释放蛋白酶和少量炎性因子，刺激巨噬细胞分泌基质降解蛋白酶，损伤纤维帽，致纤维帽变薄10，加速 VP 的形成;凋亡细胞(巨噬细胞) 被吞噬清除过程中，可诱发炎症反应，促进 AS 斑块不稳定11。巨噬细胞凋亡后，其数目减少，致使凋亡的平滑肌细胞、巨噬细胞等不能被有效吞噬，促进 AS 斑块内脂质核心形成和扩大，使纤维帽易于破裂;细胞凋亡后可释放促血栓形成物质(如组织因子等) 12，促进血栓的形成。可见，随着随着 IL-18 刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势，相反，斑块的帽/核比值有下降趋势，而斑块内的细胞凋亡指数和斑块的帽/核比值也呈显着负相关，这就提示了 IL-18 通过诱导斑块内的细胞凋亡可能是促进 VP 形成的重要机制。在临
