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1、生物化学实验报告生物化学实验报告姓姓 名：名： 学学 号：号： 专业年级：专业年级： 组组 别：别： 生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称实验名称质粒质粒 DNA 的提取、定量、酶切鉴定与的提取、定量、酶切鉴定与 PCR实验日期实验日期实验地点实验地点合作者合作者指导老师指导老师评分评分XX教师签名教师签名李某某李某某批改日期批改日期2013-06-03格式要求：格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，小四号，宋体，1.5 倍行距；数字、英文用倍行距；数字、英文用 Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色
2、标出。蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。1、实验目的实验目的1、掌握 PCR 基因扩增的原理和操作方法2、掌握碱裂解法提取质粒的方法 3、了解和掌握紫外吸收检测 DNA 浓度与纯度的原理和测定方法 4、 了解质粒酶切鉴定原理5、学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒 DNA 的构型、分子量的大小2、实验原理实验原理1、PCR：在 DNA 聚合酶催化下，以 DNA 为模板，特定引物为延伸起点，dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制 DNA，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。 PCR 一次循环的具体反应步骤为：（1）变性：加热反应系统至 95，使模板 D
3、NA 在高温下完全变性，双链解链 。 （2）退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板 Tm 值的5左右），与模板 DNA 互补退火形成部分双链。 （3）延伸：溶液反应温度升至中温 72，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2、质粒 DNA 的提取：（1）碱裂解法：1）基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异：2）高碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 均变性；3）当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而
4、形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。（2）离心层析柱：1）硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3）低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。3、质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）：1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性。2）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。3）A260/A280 比值可以反应 DNA 的纯度。4、质粒 DNA 的酶切鉴定：限制性内切酶是 DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制
5、性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链 DNA。分子克隆中常用的为 II 类限制酶，其识别位点长度为4、5 或 6 个核苷酸的反向重复序列。 5、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的 DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法：三、材料与方法
6、：以流程图示意（一）材料：1、PCR:仪器：PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液：(大肠杆菌 DH5a 菌株，含靶基因 CHD5 片段的 pMD19-T)、无菌去离子水、2Premix Taq、引物2、质粒 DNA 的提取仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅材料：含 pMD19-T 质粒的大肠杆菌 DH5试剂： 溶液 S1、溶液 S2、溶液 S3、去蛋白液 W1、漂洗液 W2、洗脱液 Eluent3、质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒4、质粒 DNA 的酶切鉴定仪器：1.5ml
7、 的 EP 管、微量加样枪材料：无菌水、10M 酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5、琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液方法：1、PCR取 0.2 ml PCR 反应管一 只用微量加样枪加入灭菌去离子水 6.0l6l12l将反应管放到 PCR 仪上进行扩 增加入 2*Premix Taq 12.0l加入引物 1-SO100 (10mol/L) 1.0l加入引物 2-SO101 (10mol/L) 1,0l加入菌液 5.0l离
8、心 10min2、质粒 DNA 的提取菌液离心并弃上清液加 400.0l 溶液 S3颠倒数次， 放置 3- 5min离心 13000rpm,1min离心 13000rpm,1min离心 13000rpm,1min弃滤液放入一个干净的离心管中，在吸附膜的 中间加 50.0l 洗脱液 Eluent,放置 1min空柱离心 13000rpm,2min离心 13000rpm,1min3、质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）加 250.0l 溶液 S2离心 13000rpm,10min取上清 700.0l 加到吸附柱 中弃滤液，加入 500.0l 去蛋白液 W1弃滤液，加入 500.0l 漂洗液
9、W2旋涡振荡 悬浮沉淀加 250.0l 溶液 S1颠倒 6-8 次用蒸馏水将石英比色皿洗净，用擦镜纸擦 干将石英比色皿放入检测槽，按 blank 键调 零往石英比色皿中加入 2.0l 样品，混 匀往石英比色皿中加入 98.0l 蒸馏水记录数据，重复三次取平均 值将石英比色皿放入检测槽，按 sample 键检 测4、质粒 DNA 的酶切鉴定取一洁净的 1.5mlEP 管加入无菌水 6.0l加入质粒 DNA 10.0l加入 10M 酶切缓冲液 6.0l加入 Hind III (15U/ul) 1.0l加入 EcoR I (12U/ul) 1.0l移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37水浴 1.5h5
10、、琼脂糖凝胶电泳用微量加样枪各吸取 10.0l 样品，按序号加入到电泳仪的凝胶孔 中电泳 30min取出凝胶紫外光下观察，拍 照往质粒 DNA、酶切 DNA 片段样品中按 10:1 的比例加入 Gelview 染料，混匀，室温放置 1min四、结果与讨论：四、结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。（一）结果实验现象：1、PCR:如图 1 所示，PCR 样品呈荧光绿色。2、质粒 DNA 的提取：（1）加入溶液 S1 后，细菌沉淀部分溶解，旋涡振荡后出现悬浮现象。（2）加入溶液 S2 并混匀，如图 2 所示，溶液变清。（3）加入溶液 S3，有白色絮状沉淀
11、生成。图 1 PCR 样品 图 2 溶液变清3、质粒 DNA 的定量分析：图 3 质粒 DNA 的定量分析数据记录4、质粒 DNA 的酶切鉴定：如图 4 所示，加入 10M 酶切缓冲液后，溶液呈紫色。5、琼脂糖凝胶电泳：如图 5 所示，电泳时，可观察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度不同。每组中，PCR 样品电泳速度最快，质粒 DNA 样品和酶切后 DNA 样品速度几乎相同。在紫外检测仪条件下，可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。图 4 溶液呈紫色 图 2 电泳结果（自然光下）实验数据：测量次数质粒 DNA 浓度(g/ml)Ratio 值(A260/A280)1723.4221
12、261.8631191.87平均值122.51.865表格 1 质粒 DNA 的定量分析数据记录注：因第一次测量数据偏差较大，故弃去第一次数据，取后两次数据计算其平均值。图谱：图 4 琼脂糖凝胶电泳图（二）讨论 1、质粒 DNA 的定量分析数据分析:5000 bp3000 bp2000 bp 150 0 bp 100 0 bp 750 bp 500 bp250 bp 100 bpABCA.质粒B.PCRC.酶切纯净的 DNA A260/A280 比值为 1.8，纯净的 RNA A260/A280 比值为 2.0。由表格1 可知，本次试验测得质粒 DNA 的 Ratio 值为 1.865。A26
13、0/A280 比值略大于 1.8，但小于 1.9，表示 DNA 样品较纯,符合实验要求，可能有少量 RNA 杂质。若 A260/A280比值1.9，则表示样品中含 RNA 杂质，需用 RNA 酶去除。若 A260/A280 比值1.6，则表示样品中有蛋白质或其它杂质的污染，需重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质。2、电泳图谱分析:如图 4 所示，可见质粒 DNA 呈现 3 条带，PCR 产物 1 条带，酶切后的质粒 DNA呈现 2 条带。将样品与 Maker 相比较，质粒 DNA 的分子大小在 40005000bp，酶切反应的质粒 DNA 片段分子大小在 30004000bp 和 45
14、0700bp，PCR 的 DNA 分子大小在450700bp。理论上来说，质粒大小为:2692bp+400bp=3092bp，酶切片段约为26922792bp 和 400500bp 两段，目的片段为 400bp，预期 PCR 产物大小约400500bp。由此可见，样品结果略大于理论值。本次试验所用材料大肠杆菌 DH5a 菌株的质粒中含有三种 DNA，分别为超螺旋质粒 DNA、线性 DNA 和开环状质粒 DNA。这三种 DNA 有不同的迁移率，迁移速度最快的是超螺旋型，其次是线性分子，最慢的是开环状分子。因此，条带从上到下依次为：开环状分子、线性分子、超螺旋型 DNA。开环状分子的条带较不明显，
15、可能是因为其含量较少。3、注意事项:（1）在 PCR 中，如果配好的反应液较多沾到管壁上，要将 PCR 反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后才将反应管放到基因扩增仪上。（2）在质粒 DNA 提取的实验中，加入溶液 S1 并旋涡振荡后，菌液一定悬浮均匀，不能有结块。加入溶液 S2 后，时间不能太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次。加入溶液S3 后，复性时间不宜过长。（3）取上清时注意不要碰到沉淀物。（4）空柱离心后应更换一个干净的离心管。（5）进行质粒 DNA 的定量分析时，要将比色皿中的样品和蒸馏水完全混匀。（6）每次测量前应将比色皿用蒸馏水冲洗干净。（7）在电泳实验中，点样时枪头
16、下伸，点样孔内不能有气泡。（8）在电泳中，Geldview 有毒，切勿用手接触。4、思考题:（1）碱法提质粒中溶液 I、II、III 的作用？答：溶液 I：含有溶菌酶，葡萄糖和 EDTA。溶菌酶具有溶菌的作用。葡萄糖可以增加溶液的黏度，维持渗透压，以保护 DNA，防止 DNA 受机械切力作用降解。EDTA 可以螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对 DNA 的降解作用，加强溶菌酶的溶菌效果。溶液 II：含有 NaOH 和 SDS。NaOH 提供高碱环境，使 DNA 变性。SDS 能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，解聚细胞中的核蛋白，与蛋白质结合为复合物使蛋白质沉淀下来。溶液 III：起缓冲液的作用，调节 pH 至中性使质粒 DNA 复性。溶液还提供了高盐环境，有利于变性
