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1、课题1 微生物的实验室培养,专题2 微生物的培养与应用,1.提供营养和条件,2.防止污染,（一）.微生物的类群,微生物,原核类:,真核类,非细胞类：,细菌、衣原体、放线菌、蓝藻、支原体,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,一.基础知识,1.细菌的外形与大小,细菌：单细胞不分枝的原核微生物。 细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察,图1-1 常见的三种细菌典型形态 A.球菌 B.杆菌 C.弧菌,细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。,2.细菌的构造,图1-3
2、细菌的结构,3.细菌的菌落,.定义：,单个细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。,.功能：,每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。,几种菌落及其形态,4.细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。 自养菌:分类,举例?异养菌: 腐生菌 寄生菌 大部分病原菌,光合自养型:光合细菌 化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌,微生物需要的五大类营养要素物质是：,.微生物需要的营养物质及功能,1.碳源 2.氮源 3.生长因子 4.无机盐 5.水
3、,：凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。,无机碳源：CO2；NaHCO3等,有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等,构成细胞物质和一些代谢产物 异养微生物的能源,.概念,.来源：,.作用：,1.微生物的碳源,无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。,有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。,主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。,2.微生物的氮源,.概念：,.来源：,.作用：,3.生长因子,.常见的生长因子：,.概念：,.作用：,微生物生长不可缺少的微量有机物。,酶和核酸的组成成分。,维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。,.培养基,1.概念：培
4、养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养基质。,3.培养基的类型和用途,2.培养基的成分：,一般都含有水、生长因子、碳源、氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质、渗透压、以及氧气等的要求。,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,
5、鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,液体培养基：工业生产 连续培养 增殖,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基：可以形成菌落，菌苔。用于分离、鉴定、计数,半固体培养基：可以用于检测微生物是否可以运动及保存,无动力 有动力(弥散),根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基:,天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺
6、点：来源受限；成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析；易发生支原体污染。,天然培养基：,选择培养基,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞,可抑制细菌、放线菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成,其细胞壁是由纤维素、几丁质、葡聚糖组成,练习,1.不能作为异养微生物碳源的是（ ）A牛肉膏 B含碳有机物C石油 D含碳无机物,D,2.下列关于生长因子的说法中，不正确的一项是 （ ）A是微生物生长不
7、可缺少的微量有机物B是微生物生长不可缺少的微量矿质元素C主要包括维生素、氨基酸和碱基等D一般是酶和核酸的组成成分,B,4.通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在碳源为纤维素的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素，可以抑制细菌和放线菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出（ ）大肠杆菌 霉菌 放线菌 纤维素分解菌A. B. C. D.,解析：选A。本题考查了微生物分离知识。纤维素分解菌可以利用纤维素，大部分微生物却不能；培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌，但霉菌能够生长。,思考： 1. 获得纯净培养物的关键？2. 无菌技术除了用来防止实验室的培养
8、物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？（P15旁栏思考）3. 消毒和灭菌有何不同？4. 常用的消毒和灭菌方法有哪些？,无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,.无菌技术,防止外来杂菌的入侵,思维激活 用酒精擦拭实验者手臂属消毒还是灭菌？70%与95%的酒精，哪一种效果更好？为什么？提示 酒精擦拭属化学消毒，酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。,（1）消毒和灭菌的区别,为抵抗不良环境可形成细菌的休眠体芽孢,芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸
9、3小时以后才死亡。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,芽孢的了解,表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯 。,（2）灭菌,a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具 (接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,干热灭菌 160170 ；12h,能耐高温的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿),高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min,通常用于培养基的灭菌,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 培养细菌用的培养基与培养皿 玻棒、试管、烧瓶和吸
10、管 实验操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌； （3）需要消毒。,P16旁栏思考,4.微生物实验室培养的基本操作程序,器具的灭菌培养基的配制 培养基的灭菌倒平板 微生物接种恒温箱中培养 菌种的保存,三、实验操作,（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,1.计算 2.称量 3.溶化 4.灭菌 5.倒平板,操作步骤：,配方：,1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成,倒平板技术,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.培养基灭菌后，需
11、要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中，错误的是（ ）A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B.牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用
12、玻棒取出称量纸C.待培养基冷却至50左右时，进行倒平板D.待平板冷却凝固约5min10min后，将平板倒过来放置,解析：选A。本题考查了牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备过程。其顺序为：计算称量溶化灭菌倒平板，故A项错误。,二、纯化大肠杆菌,接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落。,微生物的接种技术,平板划线的操作方法 交叉划线法 连续划线法,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，
13、菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,
14、3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板法,原理： 将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。,6支试管，分别加入9ml无菌水,101,102,103,104,105,106,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板,不超过0.1ml,
15、1个不涂布作空白对照,滴,灼,试,涂,4.菌种的保存,固体斜面培养基上4保存，菌种易被污染或产生变异,3.微生物的恒温培养,.长期保存：,20甘油管在 冷冻箱中保藏,.临时保藏：,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12 h与2
16、4 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,本课题知识小结:,【典例解析】,例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是( )A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,
