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1、怎样用好高效液相色谱,福立分析仪器有限公司,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,常见的液相色谱仪问题 色谱峰加宽 分辨率低 裂峰 柱压比预期值高,液 相 色 谱 仪 的 使 用,正确连接液相色谱仪系统可使用户受益,原因如下: 相对比较便宜 不需要花费大量的时间 系统中大多数流体连接均易于检修 通常有助于避免不必要的硬件替换 接头对正确连接至关重要,因此知道接头的 一些基本特点也很重要。,液相色谱仪的正确连接,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头的普通特征 螺纹(10-32, -28, M6x1)管道外径(1/16”、1/32”、1/8”) 端口几何形状(
2、锥形、平底) 管套直径,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,套圈固定管道,并且始终以相同方式固定用力按入圆锥形端口,如下图所示,套圈锥度 (或角度),端口锥度 (或角度),接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,然后在套圈接触内套处压紧管壁。,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,通用端口有以下特征: 螺纹 管道尺寸 内部几何形状 但并非所有的接头都是通用的!,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,管套的深度并非通用!,即使是最好的接头,如果不正确使用也会 产生许多问题。为什么会出
3、现问题?,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,以下示例解释了不匹配的接头导致多种色谱法问题的原因:,如果前端太长,套圈不能密封因而会发生泄漏,如果前端太短,套圈可以密封但是将会导致无效空间(死体积)和混合的发生,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连接,连接出现泄漏后将会引发以下问题: 系统压力损失 注射假象(鬼峰) 出现混合室(死体积)将会引发以下问题: 色谱峰加宽 分辨率减低 显著残留 裂峰 引发色谱法问题的原因很多时,接头不匹配或使用不当将可能导致液相色谱仪的所有主要问题发生!,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连
4、接,选择匹配的接头时,应首先清楚以下问题: 使用的端口螺纹类型(例如, 10-32、 -28 等。) 使用的端口几何尺寸 (例如,锥形或平底) 所需连接的管道外径(例如, 1/16”, 1/8”) 是否可以手动紧固连接 接头应与哪些化学药品兼容 接头应该承受多大压力,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,关于液相色谱仪中的管道,以下三个要素必须考虑: 管道的正确型号 管道的最有效尺寸 切割管道的合适工具 如果想获取最好的色谱法效果,必须考虑这三个方面!,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,如果您想选择适合应用需要的管道类型,请考虑以下问题:
5、 管道在系统中的使用位置 哪种管道材料能够实现最好的兼容性 产生多少压力 可提供多种不同类型的管道 高压管道:不锈钢、PEEK、Radel R、 PEEKsil等。 低压管道: Teflon FEP、 Teflon PFA、Tefzel等。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,选择合适的管道尺寸时,请考虑以下问题: 接受端口需要什么尺寸的管道? 流速多少? 管道将会产生多大压力? 接头提供的管道尺寸是多少? 请始终注意 -高压管道最常见的尺寸为:1/16” OD x .010” ID -低压管道最常见的尺寸为: 1/8” OD x 1/16” ID,液 相 色 谱
6、仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,这是系统低压、 高流量区域。,这是系统高压、 低流量区域。,这是系统低压、 低流量区域。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,在具体应用中,仅仅选择合适的管道类型和正确的管道尺寸还远远不够,但是 如果管道切割不当, 那么结果可能仍不理想。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,正确的切割技术确实能影响色谱法的质量不正确切割 正确切割,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,储液器和泵之间的管道连接 管道通常用Teflon材料制造,尺寸为1/8” OD x 1/16” ID。 将管
7、道连接至泵上的接头通常为-28螺纹,平底几何形状。 泵和检测器之间的管道连接 管道通常用PEEK聚合体或不锈钢材料制造,尺寸为: 1/16” OD x .010” ID 或稍小。 将管道连接至系统部件上的接头通常为10-32 螺纹,锥形 几何形状。 检测器之后的管道连接 管道通常用Teflon材料制造,尺寸为1/16” OD,选择正确接头和管道的一般准则,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,管道内径的公英制换算,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,HPLC系统不同部位的管道,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,不同色谱柱的管道使用指南,液
8、相 色 谱 分 析,分析型液相色谱仪定性及定量分析a.灵敏度的要求b.样品的复杂性c.样品量的要求d.精度及准确度的要求e.容易使用,液 相 色 谱 分 析,分配色谱概述,反相色谱的主要类型,基于分之的极性分离 洗脱次序:一般为反相,即极性高的先被洗脱 常用流动相: 有机溶剂如甲醇、乙腈,水 应用添加剂,成为离子对、离子抑制方法 常用固定相: 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相,液 相 色 谱 分 析,键合相色谱柱,以硅胶为基质,通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基 等基团联在基质上,作为固定相。 优点: 固定相稳定,不易流失。 应用广泛,可使用多种溶剂。 消除硅羟基的不良影响
9、。 缺点: PH值不能小于3或大于8 同样填料,各种牌号色谱柱不尽相同。,液 相 色 谱 分 析,色谱柱化学及外形的关系,液 相 色 谱 分 析,Q:需要什么样的分离结果?A:分辨率高。,液 相 色 谱 分 析,什么是色谱的分辨率?,分辨率R的公式:,液 相 色 谱 分 析,影响分辨率的因素:k,a,N,分辨率的方程:,k是容量因子,表达了样品与填料的作用强弱。 a 是选择性系数,描述两化合物分离的好坏程度,是化学因素。 N 是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度。,液 相 色 谱 分 析,色谱柱的柱效N,理论塔板数计算公式:,液 相 色 谱 分 析,提高柱效( N )的方法,色谱柱本身 减小
10、填料的颗粒度 找到最佳的流速(根据不同的内径) 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长,液 相 色 谱 分 析,其他影响柱效( N )的因素,柱外效应 连接管路 进样器 检测器 进样体积 样品浓度,液 相 色 谱 分 析,容量因子 k,与峰高的关系 与R的关系,改变k值的方法: 调节流动相中有机溶剂浓度、pH值、离子强度等 梯度淋洗,k=(tR-t0)/ t0,液 相 色 谱 分 析,选择性系数 a,定义:,a1时两组分分不开,,改变a的途径: 改变流动相种类 改变固定相 改变温度 改变样品的本身性质,液 相 色 谱 分 析,a、k、N 如何控制分辨率,原始分离状态,改变 k 后,改变 a 后,
11、改变 N 后,液 相 色 谱 分 析,开发液相色谱分析方法,分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。 在开发色谱方法时,有很多因素是很重要的。除分辨率之外,以下因素都要考虑。1.灵敏度 5.成本2.载样量 6.容易使用3.分析速度 7.色谱柱寿命4.溶剂消耗 8.效率,液 相 色 谱 分 析,液相色谱分析方法的建立1,建立液相色谱分析方法通常有以下几步:(1)分子量在样品预处理或GPC分析时有用 (2)选择合适的液相色谱方法(正相、反相或其他); (3)选择合适的色谱柱; (4)溶解度选择流动相的条件 (5)官能团有否离子化基团?保留特性如何? (6)样品的基质考虑是否要前处理,如何前处理,液 相
12、色 谱 分 析,液相色谱分析方法的建立2,续前一页(7)选择合适的K值的条件; (8)选择良好的峰位(a值); (9)选择良好的色谱柱条件(N值); (10)检测特性是否有紫外吸收?荧光? (11)用实测样品解决出现的特殊问题; (12)证实方法的正确性。,液 相 色 谱 分 析,选择液相色谱的方法,主 要 液 相 色 谱 方 法 特 性,液 相 色 谱 分 析,选择液相色谱的方法,次 要 液 相 色 谱 方 法 特 性,液 相 色 谱 分 析,液相色谱的保留,保留时间tR的初步估计: 保留时间tR 死时间t0(1+峰容量因子k) 峰的容量因子k(保留时间tR死时间t0)/死时间t0t00.5
13、Ld2 左式中:t0进样峰的出峰时间 k=(tR-t0)/ t0 tR峰的保留时间L柱长(cm) tR= t0(1+ k) d柱内径(cm)k峰的容量因子,液 相 色 谱 分 析,反相色谱不同配比流动相与容量因子值,液 相 色 谱 分 析,溶 剂 强 度,改变流动相的组成或溶剂的强度,就可以改变K和tR。在一定 的条件下,减少保留时间或缩短分析时间的溶剂(小tR和K值)为 强溶剂,增加或延长分析时间的溶剂(大tR和K值)为弱溶剂。例 如,在反相色谱中,水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增 加甲醇的比例,流动相变强。液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为:正己烷、氯仿、二氯 甲烷、甲基叔丁醚、乙
14、醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲 醇。在反相色谱中有机溶剂增加10左右,tR和K值要减少2-3倍。,液 相 色 谱 分 析,峰 位 的 重 排,在分析多组分样品时,仅改变流动相的强度(组成百分比) 而不改变其组成,一般仅仅改变所有组分的tR,不会发生峰 位重排。在反相色谱中,下列条件改变可能发生峰位重排: (1)流动相中换了强溶剂种类; (2)pH值的改变; (3)柱填料的改变; (4)柱温的改变; (5)流动相组成的改变(如加入离子对试剂三乙基胺等),液 相 色 谱 分 析,液相色谱压力计算,(4.6内径柱),式中: L柱长,(mm);e流动相粘度;F流速,mL/min dc柱内径,(
15、mm);dp柱填料直径,(mm),反相色谱常用流动相的粘度值(mPas)(25),注1:左表红线框内 的数字即为该溶液 与水混合后的粘度 (在25时)即e 注2:以上计算公式 是针对新柱而言。,液 相 色 谱 分 析,实验室常备的流动相和固定相,为满足液相色谱的方法选择,实验室应该常备以下的流动相和固定相 (1)流动相:甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷二氯甲烷, 这些溶剂基本上能满足90以上的液相色谱分离问题。 (2)固定相:C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱合氨基柱。,几点注意事项,色谱柱和流动相确定以后,为想获得满意的色谱分离,可进 一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进 样前要进行很完全的样品预处理,另外,许多样品则需要梯度洗 脱,当色谱条件有所改变时,需要寻找更合适的分离条件。,液 相 色 谱 分 析,分析方法的开发,第一步干什么? 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品,或有否类似样品的分析方法; 查文献,各种手册,如药典、农药手册以及国家标准; 向仪器制造商询问。 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理,自己开发方法。 充分了解自己的样品,液 相 色 谱 分 析,分析方法的开发,分析时要了解哪方面的情况? 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组分要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验而要求方法容易使用?,