怎样用好液相色谱1[1]

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1、怎样用好高效液相色谱,福立分析仪器有限公司,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,常见的液相色谱仪问题 色谱峰加宽 分辨率低 裂峰 柱压比预期值高,液 相 色 谱 仪 的 使 用,正确连接液相色谱仪系统可使用户受益，原因如下： 相对比较便宜 不需要花费大量的时间 系统中大多数流体连接均易于检修 通常有助于避免不必要的硬件替换 接头对正确连接至关重要，因此知道接头的 一些基本特点也很重要。,液相色谱仪的正确连接,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头的普通特征 螺纹（10-32， -28， M6x1）管道外径（1/16”、1/32”、1/8”） 端口几何形状（

2、锥形、平底） 管套直径,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,套圈固定管道，并且始终以相同方式固定用力按入圆锥形端口，如下图所示,套圈锥度 （或角度）,端口锥度 （或角度）,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,然后在套圈接触内套处压紧管壁。,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,通用端口有以下特征： 螺纹 管道尺寸 内部几何形状 但并非所有的接头都是通用的!,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,管套的深度并非通用!,即使是最好的接头，如果不正确使用也会 产生许多问题。为什么会出

3、现问题？,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,以下示例解释了不匹配的接头导致多种色谱法问题的原因：,如果前端太长，套圈不能密封因而会发生泄漏,如果前端太短，套圈可以密封但是将会导致无效空间（死体积）和混合的发生,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连接,连接出现泄漏后将会引发以下问题： 系统压力损失 注射假象（鬼峰） 出现混合室（死体积）将会引发以下问题： 色谱峰加宽 分辨率减低 显著残留 裂峰 引发色谱法问题的原因很多时，接头不匹配或使用不当将可能导致液相色谱仪的所有主要问题发生!,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连

4、接,选择匹配的接头时，应首先清楚以下问题： 使用的端口螺纹类型（例如， 10-32、 -28 等。） 使用的端口几何尺寸 （例如，锥形或平底） 所需连接的管道外径（例如， 1/16”， 1/8”） 是否可以手动紧固连接 接头应与哪些化学药品兼容 接头应该承受多大压力,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,关于液相色谱仪中的管道，以下三个要素必须考虑： 管道的正确型号 管道的最有效尺寸 切割管道的合适工具 如果想获取最好的色谱法效果，必须考虑这三个方面！,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,如果您想选择适合应用需要的管道类型，请考虑以下问题：

5、 管道在系统中的使用位置 哪种管道材料能够实现最好的兼容性 产生多少压力 可提供多种不同类型的管道 高压管道：不锈钢、PEEK、Radel R、 PEEKsil等。 低压管道: Teflon FEP、 Teflon PFA、Tefzel等。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,选择合适的管道尺寸时，请考虑以下问题： 接受端口需要什么尺寸的管道？ 流速多少？ 管道将会产生多大压力？ 接头提供的管道尺寸是多少？ 请始终注意 -高压管道最常见的尺寸为：1/16” OD x .010” ID -低压管道最常见的尺寸为： 1/8” OD x 1/16” ID,液 相 色 谱

6、仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,这是系统低压、 高流量区域。,这是系统高压、 低流量区域。,这是系统低压、 低流量区域。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,在具体应用中，仅仅选择合适的管道类型和正确的管道尺寸还远远不够，但是 如果管道切割不当， 那么结果可能仍不理想。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,正确的切割技术确实能影响色谱法的质量不正确切割 正确切割,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,储液器和泵之间的管道连接 管道通常用Teflon材料制造，尺寸为1/8” OD x 1/16” ID。 将管

7、道连接至泵上的接头通常为-28螺纹，平底几何形状。 泵和检测器之间的管道连接 管道通常用PEEK聚合体或不锈钢材料制造，尺寸为： 1/16” OD x .010” ID 或稍小。 将管道连接至系统部件上的接头通常为10-32 螺纹，锥形 几何形状。 检测器之后的管道连接 管道通常用Teflon材料制造，尺寸为1/16” OD,选择正确接头和管道的一般准则,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,管道内径的公英制换算,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,HPLC系统不同部位的管道,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,不同色谱柱的管道使用指南,液

8、相 色 谱 分 析,分析型液相色谱仪定性及定量分析a.灵敏度的要求b.样品的复杂性c.样品量的要求d.精度及准确度的要求e.容易使用,液 相 色 谱 分 析,分配色谱概述,反相色谱的主要类型，基于分之的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相,液 相 色 谱 分 析,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基 等基团联在基质上，作为固定相。 优点： 固定相稳定，不易流失。 应用广泛，可使用多种溶剂。 消除硅羟基的不良影响

9、。 缺点： PH值不能小于3或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同。,液 相 色 谱 分 析,色谱柱化学及外形的关系,液 相 色 谱 分 析,Q：需要什么样的分离结果？A：分辨率高。,液 相 色 谱 分 析,什么是色谱的分辨率？,分辨率R的公式：,液 相 色 谱 分 析,影响分辨率的因素：k，a，N,分辨率的方程：,k是容量因子，表达了样品与填料的作用强弱。 a 是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度，是化学因素。 N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。,液 相 色 谱 分 析,色谱柱的柱效N,理论塔板数计算公式：,液 相 色 谱 分 析,提高柱效( N )的方法,色谱柱本身 减小

10、填料的颗粒度 找到最佳的流速（根据不同的内径） 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长,液 相 色 谱 分 析,其他影响柱效( N )的因素,柱外效应 连接管路 进样器 检测器 进样体积 样品浓度,液 相 色 谱 分 析,容量因子 k,与峰高的关系 与R的关系,改变k值的方法： 调节流动相中有机溶剂浓度、pH值、离子强度等 梯度淋洗,k=(tR-t0)/ t0,液 相 色 谱 分 析,选择性系数 a,定义：,a1时两组分分不开，,改变a的途径： 改变流动相种类 改变固定相 改变温度 改变样品的本身性质,液 相 色 谱 分 析,a、k、N 如何控制分辨率,原始分离状态,改变 k 后,改变 a 后,

11、改变 N 后,液 相 色 谱 分 析,开发液相色谱分析方法,分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。 在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下因素都要考虑。1.灵敏度 5.成本2.载样量 6.容易使用3.分析速度 7.色谱柱寿命4.溶剂消耗 8.效率,液 相 色 谱 分 析,液相色谱分析方法的建立1,建立液相色谱分析方法通常有以下几步：（1）分子量在样品预处理或GPC分析时有用 （2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）； （3）选择合适的色谱柱； （4）溶解度选择流动相的条件 （5）官能团有否离子化基团？保留特性如何？ （6）样品的基质考虑是否要前处理，如何前处理,液 相

12、色 谱 分 析,液相色谱分析方法的建立2,续前一页（7）选择合适的K值的条件； （8）选择良好的峰位（a值）； （9）选择良好的色谱柱条件（N值）； （10）检测特性是否有紫外吸收？荧光？ （11）用实测样品解决出现的特殊问题； （12）证实方法的正确性。,液 相 色 谱 分 析,选择液相色谱的方法,主 要 液 相 色 谱 方 法 特 性,液 相 色 谱 分 析,选择液相色谱的方法,次 要 液 相 色 谱 方 法 特 性,液 相 色 谱 分 析,液相色谱的保留,保留时间tR的初步估计： 保留时间tR 死时间t0(1+峰容量因子k） 峰的容量因子k（保留时间tR死时间t0）/死时间t0t00.5

13、Ld2 左式中：t0进样峰的出峰时间 k=(tR-t0)/ t0 tR峰的保留时间L柱长(cm) tR= t0(1+ k) d柱内径(cm)k峰的容量因子,液 相 色 谱 分 析,反相色谱不同配比流动相与容量因子值,液 相 色 谱 分 析,溶 剂 强 度,改变流动相的组成或溶剂的强度，就可以改变K和tR。在一定 的条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂（小tR和K值）为 强溶剂，增加或延长分析时间的溶剂（大tR和K值）为弱溶剂。例 如，在反相色谱中，水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增 加甲醇的比例，流动相变强。液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为：正己烷、氯仿、二氯 甲烷、甲基叔丁醚、乙

14、醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲 醇。在反相色谱中有机溶剂增加10左右，tR和K值要减少2-3倍。,液 相 色 谱 分 析,峰 位 的 重 排,在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比） 而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰 位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排： （1）流动相中换了强溶剂种类； （2）pH值的改变； （3）柱填料的改变； （4）柱温的改变； （5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）,液 相 色 谱 分 析,液相色谱压力计算,(4.6内径柱),式中： L柱长，(mm)；e流动相粘度；F流速，mL/min dc柱内径，(

15、mm)；dp柱填料直径，(mm),反相色谱常用流动相的粘度值（mPas）（25）,注1：左表红线框内 的数字即为该溶液 与水混合后的粘度 （在25时）即e 注2：以上计算公式 是针对新柱而言。,液 相 色 谱 分 析,实验室常备的流动相和固定相,为满足液相色谱的方法选择，实验室应该常备以下的流动相和固定相 （1）流动相：甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷二氯甲烷， 这些溶剂基本上能满足90以上的液相色谱分离问题。 （2）固定相：C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱合氨基柱。,几点注意事项,色谱柱和流动相确定以后，为想获得满意的色谱分离，可进 一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进 样前要进行很完全的样品预处理，另外，许多样品则需要梯度洗 脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。,液 相 色 谱 分 析,分析方法的开发,第一步干什么？ 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法； 查文献，各种手册，如药典、农药手册以及国家标准； 向仪器制造商询问。 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法。 充分了解自己的样品,液 相 色 谱 分 析,分析方法的开发,分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高？ 样品的本底是否很复杂？ 有多少组分要分析？ 对分析的精确度、准确度等有多高要求？ 是否因是日常检验而要求方法容易使用？,