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1、分子生物学实验报告实验一实验一 植物基因组植物基因组 DNA 的提取及其定性、定量分析的提取及其定性、定量分析【实验目的实验目的】 通过本实验学习利用 CTAB 法从植物组织中提取 DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对 DNA 进行定性定量分析。【实验原理实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于 0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入 CTAB 缓冲液将 DNA 溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到 DNA。琼脂糖凝胶电泳是分离和
2、纯化 DNA 片段的常用技术。把 DNA 样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的 DNA 分子比分子量大的 DNA 分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质
3、量相同，但构型不同的 DNA 分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状 DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒 DNA(ocDNA)。核酸分子(DNA 或 RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在 260 nm 波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于 dsDNA 50 g/mL，ssDNA 33 g/mL 和 ssRNA 40 g/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定 260 nm 和 280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核
4、酸的纯度，若 DNA 的 A260/A280 比值高于2.0，则可能有 RNA 污染，低于 1.8 则有蛋白质污染。【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 L 量程各一支)、100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或 parafilm、吸头、1.5 mL EP 管、PE 手套和乳胶手套。二、药品三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠
5、(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。三、试剂1. 2CTAB buffer【1】2.70%乙醇【2】3.RNaseA (天根)【3】4.0.5TBE 缓冲液(工作浓度) 【4】5.6loading buffer【5】6. 核酸染料(赛百盛)7. DNA marker DL 2000(Takara)8. 酚/氯仿 (1:1, V/V) 【6】【实验步骤实验步骤】 1. 取约 100 mg 新鲜的拟南芥嫩叶放入 1.5 mL EP 管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。2. 加入 0.6 mL 2CTAB 提取液（用前加入 0.2的巯基乙醇），混匀
6、，65 水浴 30 min，每 10 min 颠倒混匀一次。3. 取出离心管，冷却后加入 0.6 mL 酚氯仿混合液，混匀。4. 11,500 rpm 室温离心 8 min(若没离好可重复一次)。5. 将上清液(约 400 L)转移到另一新的 1.5 mL 离心管中。6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心 8 min，取上清(约 350 L)。7. 加入 600 L无水乙醇，上下颠倒混匀，-80放置 30 min。8. 4，15,800 rpm 离心 20 min，弃上清。9. 1 mL 70乙醇(预冷)洗涤沉淀 2 次，上下颠倒几次，不能 vortex，7,000 g
7、 离心 3 min，弃上清，风干。10. 加入 30 L 无菌水(含 20 g/mL RNase A)，37 溶解 DNA 30 min。 11. 取 5 L DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：(1) 制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶称取 0.3 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入 30 mL 0.5 TBE 缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为 1琼脂糖凝胶液。(2) 胶板的制备胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙） ，形成一个模具。 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 待琼脂糖凝胶液冷却到 6
8、0 左右时，加入核酸染料 1.5 L，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡） 。 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下 30-45 min） ，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。 加入 0.5 TBE 电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约 1 mm。(3) 加样加样在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于 1。用 10 L 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将 DNA marker 分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏
9、样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序） 。(4) 电泳电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动） 。DNA 的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过 5V/cm。 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处，停止电泳。 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作） ，采用凝胶成像系统拍照保存。12.紫外分光光度法测定 DNA 浓度及纯度：(1) 用 0.1TE 对待测 DNA 样品按 1:20 或合适的倍数稀释。(2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrum
10、ent Ready”时，进入核酸测定窗口。(3) 调零。先用 0.1TE 缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。(4) 吸 70 L 已稀释的 DNA 样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用 5-7 L 的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260 nm 和 280 nm 处的光密度（OD 值）及 A260/A280 nm 和 A280/A260 nm 的比率以及DNA 样品的浓度等。(5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干
11、后，再加入下一个待测样品。(6) DNA 纯度：以 A260/ A280 比值来反映。当 A260 /A280 比值2.0，说明样品存在RNA 污染，可以用 RNA 酶处理样品去除 RNA。实验结果与分析1. 1%的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组 DNA1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的 DNA 5l 样品，电泳结果如图所示有 DNA 条带出现，表明已经成功提取到了拟南芥的基因组 DNA。C 组电泳结果如图所示2.DNA 样品的 OD 检测检测 OD 值C1：浓度：浓度:1061.7 ng/OD260/OD280：1.87表明表明：C1 接种 DNA 质量良好。 （如下图所示）C2：浓度浓度:1
12、017.6ng/ OD260/OD280：1.86表明表明:C2 接种 DNA 质量良好。 （如下图所示）C3：浓度浓度:711.0ng/ OD260/OD280：1.86表明表明:C3 接种 DNA 质量良好。 （如下图所示）注意事项注意事项：1、磨样时要反复插入液氮中冷冻，但要避免液氮进入管中；2、取酚氯仿混合液时要吸取下层；3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀；4、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层；5、晾干沉淀时，要尽可能的吸除酒精。实验二实验二 PCR 扩增目的片段扩增目的片段【实验目的实验目的】通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。【实验原理实验原理】聚合酶链式反应（Poly
13、merase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似 DNA 分子的天然复制过程，是将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA 扩增 2n倍。典型的 PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的DNA 引物、耐热 DNA 聚合酶。PCR 的工作程序实际上是一个在模板 DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增过程分三步： 变性，加热使模板 DNA 双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段； 退火，快速降低温
14、度至 50-60 后，模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段； 延伸，溶液反应温度升至 72，耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按 53方向复制出互补 DNA ，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的 DNA 量就增加一倍，新形成的 DNA 链又成为下一轮循环的模板。经过 25-30 个循环后，DNA 可扩增 106-109倍。PCR 扩增的特异性取决于引物与模板 DNA 的结合。【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材PCR 热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝
15、胶成像系统、移液器（0.1-2.5 L）、200 L PCR 管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000 L 量程各一支）、100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、点样板或 parafilm、吸头、PE 手套和乳胶手套。二、试剂1. 10 缓冲液2. DNA 模板 1 ng/L（以实验一 提取的拟南芥基因组 DNA 为模板）3. dNTP Mix (Takara)4引物 P3： 5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3P5： 5-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3引物溶液浓度：2 M 5. rTaq 酶 5 U/L6. 低熔点琼脂糖7. 去离子水或 TE（pH7.6）【7】【实验步骤实验步骤】 1在 200 L PCR 管内配制 20 L 反应体系：反应物 体积/LddH2O 11.3 10PCR 缓冲液 2.0dNTP 1.6（终浓度 20200 M） 引物 1 2.0（引物终浓度 0.2 M）引物 2 2.0（引物终浓度 0.2 M）模板 DNA 1.0rTag 酶 0.1 Total
