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1、,16.1 光学仪器简介 16.2 酶标仪的原理应用及操作 16.3 荧光光谱仪原理应用及操作 16.4 红外光谱仪原理应用及操作,16 酶标仪、荧光光谱仪、红外光谱仪的使用,16.1 光学仪器简介,一、光学知识回顾,1可见光的颜色和互补色：在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。平常所见的白光（日光、白炽灯光等）是一种复合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等不同颜色的单色光。,白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还可由适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。,2物质的颜色与吸收光的关系
2、： 当白光照射到物质上时，如果物质对白光中某种颜色的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所显示的颜色是吸收光的互补色。,三原色 RGB红绿蓝 印刷的三原色是RGB的互补色yellow黄，cyan青，magenta品红（或者叫洋红、红紫,光分析法：基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法；电磁辐射范围：射线无线电波所有范围；相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；光分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可取代的地位；,二、光分析法及其特点,三个基本过程：,（1）能源提供能量； （2）能量
3、与被测物之间的相互作用； （3）产生信号。基本特点： （1）所有光分析法均包含三个基本过程； （2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）； （3）涉及大量光学元器件。,三、电磁辐射的基本性质,1.电磁辐射的波动性,散射,折射与反射,衍射,干涉,偏振,波 长 cm、m、nm、A 频 率 Hz sec-1 波 数 cm-1 传播速度 cm/ sec,2.电磁辐射的粒子性,3.普朗克(Planch)公式,光电效应 康普敦效应 黑体辐射,一). 电磁辐射的波粒二象性,E -光子的能量 J, 焦耳 -光子的频率 Hz, 赫兹 -光子的波长 cm C -光速 2.99791010 cm.s-1
4、h -Planch常数 6.625610-34 J.s 焦耳. 秒,E = h = h c /,c = =/,吸收,发射,C=299,792,458米/秒,莫斯鲍尔光谱法:-射线原子核 -射线吸收,X-射线吸收光谱法: X-射线/放射源原子内层电子（n10) X -射线吸收 X-荧光光谱法: X-射线原子内层电子 特征X -射线发射,远紫外光-真空紫外区。此部分光谱会被空气吸收,二)光学分析法波谱,近红外光谱区:配位化学的研究对象,红外吸收光谱法:红外光分子吸收,远红外光谱区,电子自旋共振波谱法:微波分子未成对电子吸收,核磁共振波谱法:射频原子核自旋吸收,三)、本章仪器所用的光波,酶标仪、荧光
5、分光光度计,红外分光光度计,-射线5140 pm X-射线10-310nm 远紫外光10200nm 微波0.1100cm，射频1100 m（核磁共振）,2.电磁辐射的吸收与发射,A. 原子光谱 线光谱 Line spectra,半宽度10-210-5,原子吸收光谱,原子发射光谱,=hc/E=hc/(E1-E0)=h,1.物质的能态,原子、离子 分子,E= E1-E0 =hc/ ,B. 分子光谱 带光谱 Band spectra 有机、无机分子,半宽度20100nm,分子吸收光谱,分子发射光谱,半宽度20100nm,E= E电子+ E振动+ E转动+ E平动 =h(电子+振动+转动+平动) =h
6、c/(电子+振动+转动+平动),四、光分析法仪器的基本流程,光谱仪器通常包括五个基本单元： 光源；单色器；样品；检测器；显示与数据处理；,五、光学分析仪器定量方法,Lambert Beer 定律,A lgT lg（ It / I0)= b c,式中：A：吸光度；T:透射率；b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c：溶液的摩尔浓度，单位molL-1；：摩尔吸光系数，单位Lmol-1cm-1；,16.2 酶标仪的原理应用及操作,变相的光电比色计或分光光度计,酶标仪（MicroplateReader）是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上
7、的酶催化显色底物进行的，反应结果以颜色显示，通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中待测抗体或抗原的浓度。 酶标法又称固相酶免疫测定 ，含3个必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶反应的底物。双抗体夹心法(抗原）、间接法（抗体）、竞争法（抗原或抗体）。,1、酶标仪简介,2、酶标仪能干什么？,酶标仪广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中 酶联免疫检测试剂盒 RCH（IgG和IgM）检查通常也称为优生优育十项检查 ；T3、T4、TSH、TORCH系列、不孕系列、各种癌症标志物、伤寒、副伤寒 ；另外通过母婴传播的性传播疾病（如淋病、梅毒、HIV）和肝炎（如H
8、BV、HCV），以及胎儿的抗体，新生儿TSH的测定，疫苗反应等。,免疫诊断方法：放免（RIA）、酶免（EIA）和 发光 国内 衰退期 成长期 进入期 国外 淘汰 饱和期 成熟期,3、酶标仪的结构,常用的三种检测方法,（一）抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。具体操作步骤如下：,（1）特异性抗体与固相载体联结固相抗体洗涤杂质。 （2）受检标本与固相抗体接触反应标本中的抗原与固相抗体固相抗原抗体复合物洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体。固相载体上带有的酶量就代表标本中受检抗原的量。 （4）加底物显色。夹心式复合物中
9、的酶催化底物变为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。,二价及以上大分子抗原的检出和定量分析，不能用于半抗原等小分子的测定,（二）间接法 其原理为利用酶标记的抗体来检测已与固相抗原结合的受检抗体。操作步骤如下：,（1）特异体抗原固相载体联结 固相抗原洗涤除去杂质。 （2）稀释的受检血清中的特异性抗体固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤后固相载体上只留下特异性抗体。 （3）酶标抗免疫球蛋白（酶标抗体），与固相复合物中的抗体结合，该抗体间接地标记上酶。清洗后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。 （4）加底物显色，颜色深度代表标本中受检抗体量。,（三）竞争法,竞争法可用于测定
10、抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此，结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成正比。,（1）特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。然后洗涤。 （2）待测管中加入受检标本与一定量的酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。若受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。若受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合。这样，受检标本中抗原量越高，则由于这些抗原与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相抗体结合的机会，使酶标抗原与固相抗体的结合量越少。“参考管”中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。然后洗涤。
11、 （3）加底物显色。参考管中由于结合的酶标抗原量最多，故颜色最深。参考管中颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本中抗原的量。待测管越淡，表示标本中抗原量越多。,一、盛装比色液的容器不是使用比色皿，而是塑料微孔板。塑料微孔板常用透明的聚乙烯材料制作，它对抗原或抗体有较强的吸附； 二、酶标仪的光束是垂直通过待测液的； 三、酶标仪通常不使用A而是使用光密度OD来表示吸光度。,酶标仪和普通光电比色计的不同,1、仪器应放置在无磁场和干扰电压的位置、低于40分贝的环境下。 2、为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。 3、操作时环境温度应在1540之间，环境湿度在15%85%之间。 4、操作电压应保持稳
12、定。 5、操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。 6、保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。,4、酶标仪工作环境,5、酶标仪操作注意事项,1、使用加液器加液，加液头不能混用。 2、洗板要干净。最好使用洗板机洗板，避免交叉污染。 3、严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。 4、测量时勿碰酶标板，以防挤伤。 5、勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完毕后要洗手。 6、具有污染性、毒性和生物学危害的样品或试剂，严格按照操作说明，以防对操作人员造成损害。用后并及时清洗和消毒。 7、不得在测量过程中关闭电源。 8、使用后盖好防尘罩。 9、切勿擅自拆卸酶标仪。,16.3 荧光光谱仪原理应用
13、及操作,西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色(第一次记录荧光现象)。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。
14、,一、历史,原子荧光光谱法是1964年以后发展起来的分析方法。原子荧光光谱法是以原子在辐射能激发下发射的荧光强度进行定量分析的发射光谱分析法。所用仪器与原子吸收光谱法相近。,中国自主知识产权的光谱分析仪器，世界第一台原子荧光光谱仪诞生在中国（北京海光仪器公司）,荧光光谱法分为原子荧光和分子荧光两种,荧光分光光度计的发展经历了手控式荧光分光光度计，自动记录式荧光分光光度计，计算机控制式荧光分光光度计三个阶段；荧光分光光度计还可分为单光束式荧光分光光度计和双光束式荧光分光光度计两大系列。其他的还有低温激光Sh p olskill荧光分光光度计，配有寿命和相分辩测定的荧光分光光度计等,分子的活化与去
15、活化,外转移,内转移,荧光,系间窜跃,磷光,反系间窜跃,迟滞荧光,振动弛豫,. 无辐射跃迁的类型,振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁回到基态 内 转 移:S2S1能级之间有重叠 系间窜跃: S2T1能级之间有重叠 反系间窜跃:由外部获取能量后 T1 S2,. 辐射跃迁的类型,共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：110-4 sec 迟滞荧光:10210-4 sec,二. 荧光的发光类型,起源于基态的 共振荧光,热助 共振荧光,1. 共振荧光 发射与吸收线波长相同的荧光,起源于基态的 直跃线荧光,起源于亚稳态的 直跃线荧光,正常的 阶跃线荧光,热助 阶跃线荧光,起源于亚稳态 阶跃激发荧光,起源基态 阶跃激发荧光,2. 非共振荧光 荧光的波长与激发光不同时,Stores荧光:直跃线荧光、阶跃线荧光 Anti-stores荧光： 阶跃激发荧光,
