军团菌的分离培养与鉴定

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1、军团菌的分离培养与鉴定,福建省疾病预防控制中心 原灵 2009年6月3日,军团菌,革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛. 在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼脂培养基上生长，通常需要在37 5%CO2培养箱培养2-10天。 生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。,初步在BCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性.,军团菌,军团菌,军团菌电镜图片,军团菌科、属、种、血清型,军团菌科 (Legionellaceae ） Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlocki

2、a micdadei 军团菌属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。 军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型（serogroups)，至少有20个种可引起人感染。,军团菌种,20个种的军团菌可引起人疾病,军团菌操作生物安全性,应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全级实验室，最好在安全柜中操作。 操作人员培训。 菌种保存。,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定,样本

3、的采集和运输,（一）标本的种类 （二）标本的运输和相关生物安全要求,标本的种类,环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水；病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。1983年新疆从一瘫患羔羊后肢中分离到军团菌。,标本的运输和相关生物安全要求,在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3)贮藏在实验室或其他地方。对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20冻存备用。,水样标本中军团菌的分离方法,检测依据: 1 、ISO-11731水质军团菌检测2 、 公共场所集中空调通风系统

4、卫生规范中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录A。 适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括： 饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物质。,军团菌水质检测概括,采样 浓缩 培养 分离 鉴定,军团菌检测所需准备基本试剂,培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS) 试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液） 酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液（0.03mol/L KOH） 血清学试剂,标本浓缩所需准备仪器设备,过滤 滤器及漏斗，过滤装置需能够承受高压。 正压膜蠕动过滤泵，能够控制流速。 尼龙或聚碳酸酯滤膜 硅胶管 离心机离心力能够达到（6000

5、100）g,要有安全盖。 漩涡振荡器转速至少能够达到（2005）r/min。,培养检测所需准备材料,直径大约为90mm或100mm的无菌培养皿 培养箱，CO2能够恒温保持在（361）。 水浴箱，能够保持在（501） 显微镜或荧光显微镜。,样品采样准备材料,玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集为250-500ml，收集在容器瓶中。 如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于70）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于5分钟。 小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。 广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。 灭菌棉拭子。 一般建议用塑料包装的容器,采样后样品处

6、理,方法与步骤 样品处理 1. 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。 2. 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.220.45m滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。 3.热处理：取1ml洗脱样品置50水浴加热30min。 4.酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。,ISO-11731水质军团菌检测浓缩标本酸处理,酸缓冲液：仔细地量取17.4ml浓盐酸加到1L蒸馏水中，配成0.2mol/L的盐酸缓冲液；称14.9gKCl加到1L蒸馏水中，配成0.2mol/L的KCl溶液。将3.9ml 0.2mol/L的盐酸溶液和25

7、ml 0.2mol/L的KCl溶液混合，用1mol/L的KOH溶液调pH至2.20.2，装在一个带塞的玻璃瓶内，于室温暗处贮存，不要超过1个月。将110ml样品（浓缩或未浓缩的）放入带有螺旋帽的容器中，再将其6000g离心10min或3000g离心30min。 用无菌吸管吸取上清，使体积变为原来的一半。用振荡器或用力混合，使沉淀重悬。 加入酸缓冲液使体积和原来相同,并轻晃摇匀静置5min。,样品浓缩,离心过滤,接种,酸处理 热处理,水样的正压膜过滤法,安放滤膜； 过滤； 取膜； 洗膜。,水样的离心,将200ml左右样品倒入容积为300500ml的无菌离心瓶中； 6000g离心10min，或者3

8、000g离心30min，离心温度在1525之间； 无菌操作去除上清； 用520ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。,水样浓缩物的贮存,最好对样品立刻进行分析； 标本于（62）储藏最多不超过14天。对于军团菌来说，如果储藏于06，这种损失是最明显的。而且，温度在20或20以上时，异养生物的生长速度就会变快。,浓缩标本热处理,向无菌容器中放入（10.5）ml（浓缩或未浓缩）的标本。在（501）水浴中放置（302）min。,军团菌培养基,Muller-Hinton琼脂,第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基,活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽提物替代,CYE

9、琼脂,CYE琼脂加入-酮戊二酸,BCYE琼脂,BCYE琼脂中含有选择性抗生素,GVPC琼脂,军团菌培养基,酵母浸出物（细菌级） 10.0g琼脂 12.0g活性炭 2.0g-酮戊二酸 1.0gACES (2-乙酰基-2-氨基乙烷磺酸) 10.0gKOH（颗粒型） 2.8gL-半胱氨酸盐酸盐 0.6g焦磷酸铁 0.4g蒸馏水 补充至1000ml,BCYE培养基,L-半胱氨酸和焦磷酸铁溶液,称取0.6g L-半胱氨酸盐酸盐和0.4g焦磷酸铁分别溶解于10ml蒸馏水中，制备新鲜的L-半胱氨酸盐酸盐溶液和焦磷酸铁溶液。 分别通过0.22m的滤膜过滤除菌。贮存于无菌容器中，-20左右储存不得超过三个月。,

10、BCYE-培养基配制,将颗粒状ACES放入500ml蒸馏水中溶解。量取480ml蒸馏水，加入全部2.8gKOH颗粒，轻摇至溶解。将以上两种溶液混合，制成ACES缓冲液,用0.1mol/L KOH和0.1mol/L HCl溶液调节PH至6.9-7.0 ACES缓冲液中加入活性炭、酵母浸出物、-酮戊二酸。摇匀。 加入琼脂，微波稍化后，121高压15min。 高压后，室温或水浴中冷却至50左右。 在无菌条件下加入L-半胱氨酸溶液和焦磷酸铁溶液。 按20ml量倒入直径为90100mm的平板中，培养基的最终pH值大约为6.9左右。 待平板中的湿气干燥后，4左右储存于闭光的密闭容器中，最多可储存4周。,G

11、VPC选择性培养基,BCYE-琼脂培养基中添加下列抗生素万古霉素 0.001g/L 多粘菌素B 80000iu/L 放线菌酮 0.08g/L 无胺甘氨酸 3g/L,BCYE-Cys培养基,为不含L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照配制BCYE培养基的方法配制，不加L-半胱氨酸。,选择培养基的接种,一个GVPC培养基平板上可以接种0.10.5ml(浓缩或未浓缩) 未经处理的样品。 用无菌的涂抹器将液体均匀的涂抹在培养基表面。 用同样的方法尽可能快地将经过热处理的0.10.5ml标本接种在另外一块GVPC培养基平板上。 再用同样的方法尽可能快地将经过酸处理的0.10.5ml标本接种到第三块G

12、VPC培养基平板上。,接种标本培养,接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（361）培养7-10天。 为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）。 在含2.5-5.0% CO2的环境下培养有利于军团菌的生长。,孵育,6个GVPC平板/每份样本 37，5%CO2，培养3-10天,菌落验证：从每一个平皿上挑取2个可疑菌落，接种血平板 及接种BCYE和L半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，3537培养 2天，凡在BCYE琼脂平板上生长,而在L半光氨酸缺失的BCYE 琼脂平板及血平板不生长的则为军团菌菌落。,平板

13、的检查,观察结果：在3-10天的培养期间内，每24天至少观察3次，因为军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖。,军团菌菌落特点（1）,军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色。 一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。 在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。,军团菌菌落特点（2）,嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色。为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间。值得注意的是，新发现的

14、某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别。,军团菌菌落特点,可疑军团菌菌落的进一步鉴定,BCYE或其他培养基上传代培养 革兰染色镜检 生化鉴定 PCR检测军团菌特异性基因片段 免疫荧光的方法确定军团菌的种类,BCYE或其他培养基上传代培养（1）,至少从每块GVPC平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在BCYE和BCYE-Cys培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。 在（361）至少培养两天。 凡是在BCYE培养基上生长而在BCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌。,BCYE或其他培养基上传代培养（2）,营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-Cys培养基。

15、如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养。橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-半胱氨酸和铁离子，但随后在L-半胱氨酸缺失时生长微弱。,BCYE培养基上传代培养,革兰染色镜检,军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。,短杆状,长丝状,军团菌生化鉴定,军团菌生化特性,尿素酶试验,阴性：培养基不变色阳性：培养基由黄色变为红色,硝酸盐还原试验,阴性：无红色出现阳性：呈现红色进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。-萘胺具有致 癌性、故使用时应加注意。,明胶液化试验,