生物化学-酶讲义

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1、第二章 酶,本章内容 第一节 概述第二节 酶催化反应的机制 第三节 酶促反应动力学第四节 酶的活性调节,第一节 概述,一、酶的研究历史 1857 巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。 1897 Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。,1913 Michaelis和Menten提出米氏学说酶促动力学原理。,1926 Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。 1930 年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。,J.B.Sumner,J.H.Northrop,1969 化学合成核糖核酸

2、酶。1967-1970 从E.coli 中发现第I、第II类限制性 核酸内切酶。,20世纪80年代发现某些RNA有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。,二、酶的概念,酶是一类由活细胞产生的对其特异底物具有高效催化作用的特殊蛋白质或核酸。简单地说，酶是一类由活细胞产生的生物催化剂。,三、酶作为生物催化剂的特点,1高效性2专一性3反应条件温和4. 酶的催化活性可调节控制,酶的催化效率比化学催化剂高107-1013 倍，比非催化反应高108 -1020 倍。例如：过氧化氢分解2H2O2 2H2O + O2用Fe+ 催化，效率为610-4

3、 mol/molS，而用过氧化氢酶催化，效率为6 106 mol/molS。用-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。,1高效性,即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，这种 专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。可分为：绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。立体异构专一性：这类酶还能辨别底物不同的立体异构体，只对其中的某一种构型起作用，而不催化其他异构体。,2专一性,酶促反应一般在常温、常压、中性pH 条件下进行。 高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。,3反应条件温和,4.酶

4、的催化活性可调节控制,如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。,某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。,（一）根据酶的化学组成分类：1 单纯酶：只含有蛋白质成分，如：脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。2 结合酶：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因 子）。,四、酶的分类,*两部分在催化反应中的作用,酶蛋白决定反应的特异性 辅助因子决定反应的种类与性质,维生素 铁卟啉,辅酶:与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。,辅基:与酶蛋白结合紧密，不能用 透析或超滤的方法除去。,辅助因子,（二）根据酶蛋白结构特点分类,单体酶：由一条（或多条共价相连的）肽链组成

5、的酶分子。一般为水解酶。 寡聚酶：由两条或多条肽链组成的酶分子。为大多数酶。多酶复合体：由多种酶彼此聚合形成的复合体, 催化连续的一系列相关反应。丙酮酸脱氢酶复合体。 多功能酶：一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。高等动物的脂肪酸合酶。,由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。,一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。 由单肽链构成的，含有若干个酶活性的结构域。,五、酶的命名,（1）习惯命名方法 1.根据作用底物来命名，如淀粉酶、蛋白酶等。 2.根据所催化的反应的类型命名，如脱氢酶、转移酶等。 3.两个原

6、则结合起来命名，如丙酮酸脱羧酶等。 4.根据酶的来源或其它特点来命名，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。,(2)国际系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性质。例如：酶催化的反应: 谷氨酸 + 丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙氨酸习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶,(3)酶的国际分类法及编号国际酶学委员会根据酶催化的反应类型，将酶分为六大类，分别用1、2、3、4、5、6的编号来表示。,1、氧化-还原酶 2、转移酶 3、水解酶 4、裂合酶 5、异构酶 6、合成酶,每个酶都有一个有四个数字组成的编号,六、酶的活力测定,1.酶活力: 是表示生物材料或酶制剂中酶量的物理量。 只能用酶催化一

7、定化学反应的能力来表示。 即以在一定条件下酶所催化的化学反应(初)速度来表示。 因此酶活力用单位时间内底物的减少量或产物的增加量表示，单位为浓度/单位时间。,研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准（底物消耗低于5%）。,酶促反应的速度曲线,2.酶活力测定的基本原理,在最优化条件下(最适温度、最适pH、最适缓冲液等)，当底物足够（过量，SE ） ，在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即Vmax=KE）。故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶（活性分子）浓度，即酶活力。,3.酶活力测定的方法,（1）化学分析法 （2）分光光度计法 （3）量气法,4.酶活力的表

8、示方法,(1)酶活力单位U （Unit）：是衡量酶活力大小的计量单位,又称酶单位，规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。,根据不同情况有几种酶活力单位：国际单位IU：1961年，在最适条件下每分钟转化1mol底物所需要的酶量为一个酶活力单位。即1IU= 1mol/min 国际单位Kat：1972年，指在最适条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。即 1 Kat=1mol/sKat和IU的换算关系：1 Kat=6 IU，1 IU =16.67n Kat,习惯单位:在实际使用中,不同酶有各自的规定,如:糖化酶活力单位:在规定条件下,每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖

9、(以葡萄糖计)所需的酶量 为1个酶单位。蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1g酪氨酸所需的酶量。,(2)比活力（specific activity）酶的比活力（比活性）：每单位（一般是mg）蛋白质中的酶活力单位数（酶单位/mg蛋白）。实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶 单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质 越少），所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。,在评价纯化酶的操作方法是否优劣时，要同时考虑两个概念： 纯化倍数与回收率纯化倍数=某纯化操作后的比活力/粗提液的比活力回收率=某纯化操作后的总活

10、力/粗提液的总活力 ,总活力单位体积的酶活力(U/ml)分离溶液总体积(ml),(3)转换数（ TN or Kcat ）:,（在最适条件下，底物过量时，反应初始阶段，）每秒钟每个酶分子催化中心转换底物的分子数，或每秒钟每摩尔酶催化中心转换底物的摩尔数。,可以折算为每摩尔酶催化反应的速度，即Kcat = Vmax /E,习题举例:,称取25mg蛋白酶粉配成25ml酶溶液，从中取出0.1ml酶液，以酪蛋白为底物，每小时产生1500ug酪氨酸；取2ml酶液用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2mg。一个活力单位规定为：在标准的测定条件下，37，每分钟内产生1ug酪氨酸所需的酶量。求出：（1）1ml酶液中所含

11、的蛋白质量及活力单位； （2）此酶的比活力；（3）1g酶制剂的总蛋白含量及总活力。,第二节 酶催化反应的机制,一、酶的活性中心1. 活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基形成的一定空间结构。包括底物结合部位和催化部位。,酶活性中心,结合部位：与底物结合,使底物与酶的一定构象形成复合物，决定酶的专一性。,催化部位：影响底物中某些化学键的稳定性，催化底物转变成产物的部位，决定酶的催化效率和催化反应的性质。,酶活性中心的特点,酶活性中心的特点,酶的活性中心只有几个氨基酸组成，多为极性氨基酸。b. 活性中心的几个氨基酸残基在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同肽链上，通过肽链的盘绕折叠

12、而在空间结构上相互靠近，形成一个能与底物结合并催化底物形成产物的位于酶蛋白分子表面的特化的空间区域。c. 酶的活性中心与底物的结合通过次级键。d. 酶的活性中心具有柔性，可与底物诱导契合发生相互作用。e. 酶的活性中心位于酶分子表面的”空穴“中，为非极性环境。,2.必需基团：在酶分子中有一些基团对维持酶活性中心应有的空间构象及发挥正常的催化活性是必需的，若将这些基团改变后会导致酶的催化活性减弱甚至丧失，这些基团称为必需基团。,活性中心内外都可以有必需基团,二、酶作用专一性的机制,诱 导 契 合 学 说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。,酶（

13、E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。,（一）中间产物学说,三、酶作用高效性的机制,（二）影响酶催化效率的有关因素,1. 邻近效应和定向效应,在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心， 一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度； 另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。,邻 近 定 向 效 应,底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感

14、键产生“张力”甚至“形变” ，从而促使酶底物中间产物进入过渡态。,2. “张力”与“形变”,酶分子中的广义酸、碱基团通过提供部分质子或接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的作用。,3. 酸碱催化,4. 共价催化,催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。 某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。,5. 金属离子催化作用,金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。, 提高水的亲核性能, 电荷屏蔽作用,电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。 多种激酶(如磷酸转移酶)的底物是Mg2+ATP

15、复合物。, 电子传递中间体,许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。,6.酶活性中心的疏水环境效应,第三节 酶促反应动力学,酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶反应速度的各种因素的科学。影响酶反应速度的因素有：底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等。,在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，为一级反应。 底物浓度增大与速度的增加不成正比,为混合级反应. 当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（V max），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,一、 底物浓度对酶促反应速度的影响,(一)V-

16、S曲线,底物浓度对酶促反应初速度的影响,V 初,V max,直角双曲线,1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。,（二）米氏方程,米氏方程,当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax时, Km = S。 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 因此,米氏常数的单位为mol/L。,（三）米氏常数的意义及测定,Km 米氏常数 Vmax 最大反应速度,米氏常数Km的意义,不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。,