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1、,第二十一章,细胞凋亡及其调控的分子机制,细胞凋亡的基本概念 细胞凋亡（apoptosis)-形态学概念 或程序性细胞死亡（programmed cell death , PCD) - 功能性名称是指多细胞有机体在正常生理或病理状态下发生的一种由多基因控制的一种自发的、程序化的死亡过程。,第一节,细胞凋亡的特征及生物学意义,(一) 细胞凋亡的组织学变化 生理或病理下：只发生在单个或几个细胞，其紧邻细胞完好； 与紧邻细胞间有空隙，有离群、脱落感；不引起炎症反应 (二) 主要形态学特点(多阶段)注意点：凋亡全过程，质膜仍保持完整，细胞内容物不释放，不引起炎症反应。,一、细胞凋亡的基本特征,2. 细
2、胞核的变化,核内染色质凝聚、形成染色质块，并聚集于核的边缘呈多种形状排列（如：新月形），然后逐步分裂为碎片（核碎片形成）。,3. 细胞质的变化,(1) 胞质出现空泡，脱水浓缩，体积减少约30% (2) 细胞器的变化: A.线粒体早期体积增大，嵴增多晚期成空泡状； B失去微绒毛、细胞突起及细胞表面皱褶，膜电位下降，膜流动性下降；C. 内质网腔扩大；D. 细胞骨架变得致密和紊乱。,1. 细胞体积：变小，细胞皱缩变圆,Morphological Features of Apoptotic Cells,光镜下结果,荧光显微镜下结果,Control,apoptotic cell,apoptotic ce
3、ll,呈新月形的凋亡细胞,透射电镜结果,4. 凋亡小体(apoptotic body)的形成,* 凋亡小体的概念指凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等，含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体。 * 形成机制 （1）细胞表面突起形成-包裹膜融合、根部缩窄脱落 （2）胞内自噬体形成-向胞外释放 应注意：有时凋亡细胞膜不分割，仅发生核固缩和胞质高度浓缩成单个致密结构亦称凋亡小体。,凋亡时细胞的形态学改变,空泡化,固缩,出芽,边集,凋亡小体,透射电镜下的凋亡小体,凋亡小体正形成,凋亡小体 脱落,凋亡小体 被吞噬,（三）细胞凋亡的生化特点,1. DNA片段化（主）凋亡细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳呈特征
4、性梯状条带图谱（ladder）。机制：核小体中的组蛋白与DNA的连接键断裂，内源性核酸内切酶被激活，有控制的特异地将DNA降解为180200bp整数倍大小的若干条带。,DNA Fragmentation,2. 其它生化改变,1) 胞浆Ca2+ 和H+水平 凋亡的发生伴随胞浆Ca2+和H+水平的升高。 2) 细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻膜磷脂的不对称性分布改变, 凋亡时PS由质膜内侧翻向外侧（早期特征） 3) 线粒体细胞凋亡时，呼吸链受损，ATP合成下降，线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential, m)下降；膜通透性增加。,Fig. Chang
5、es of m after treatment with different concentrations of Res for 24h 1：Control (0 Res) 2：25mol/L Res 3：50mol/L Res4：100mol/L Res 5：200mol/L Res, m- low,（三）细胞凋亡与坏死的区别-1,细胞凋亡与坏死的区别-2,二、细胞凋亡的生物学意义,对于多细胞个体发育至关重要 对于淋巴细胞的成熟和维持免疫系统的功能至关重要 与DNA的损伤修复密切相关 与衰老密切相关,第二节,细胞凋亡的发生机制,一、细胞凋亡的酶学基础,秀丽隐杆线虫（Caenorhabditi
6、s elegans)凋亡活化基因：ced-3 ced-4凋亡抑制基因：ced-9 哺乳动物：Ced-3Caspase 家族 Ced-9-Bcl-2 家族Ced-4-凋亡活化基因1(apoptosis-activating factor-1,Apaf-1),（一）caspase家族与细胞凋亡,Caspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specific protease); 是一类与白介素-1 转化酶/线虫凋亡基因Ced (ICE/Ced)同源的一类半胱氨酸蛋白酶; 活性位点含有保守的aa序列(QACXG, X为R,Q或G); 以无活性的酶原形式合成并存
7、在于细胞中； 可以被上游Caspase或自身切割保守的ASP活化；,1. Caspase的性质和种类,已在哺乳类中发现18种，分为3个亚类： Caspase-1亚家族，Caspase-2亚家族，Caspase-3亚家族（ -3、-6、-7、-8、-9、-10） 亦可根据前体分子(procaspase)N端的原结构域(prodomain)分为2类: 启始分子(initiator)：具“Long-prodomain” 如-8、-9、-10等，为蛋白酶级联反应的启始者，其活化后再切割和活化下游Caspase； 效应分子(effector)：具“short-prodomain”，如-3、-6、-7等，
8、作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。,2. Caspase的结构特点和活化机制,Small Subunit,Caspase Activation by Cleavage,3. Caspase活化的级联反应过程,多种凋亡因素，通过多种途径活化Caspase; 凋亡时起始Caspase首先被活化,其后又切割并活化下游Caspase,级联放大,直至效应Caspase被活化； 细胞中的Caspase一旦被活化,凋亡即不可避免。,4. 效应caspase引起细胞凋亡的机制,灭活细胞内凋亡抑制蛋白 非凋亡细胞中, caspase活化的DNase (CAD)与其抑制蛋白(ICA
9、D)结合; 凋亡细胞中, caspase剪切ICAD 剪切细胞结构蛋白 在凋亡过程中, caspase在单一位点剪切核纤层蛋白(lamin), 导致核板塌陷, 染色质浓缩. 剪切效应蛋白 聚（腺苷二磷酸-核糖）多聚酶Poly (ADP- ribose) polymerase , PARP,Signal,Substrates,Execution Proteases,Amplifier Proteases,Initiator Proteases,Signal,Caspase 8, 10, Intrinsic pathway: 9,Caspase 3, 6, and 7,?,PARP, Lamins
10、 etc.,PARP: Poly (ADP- ribose) polymerase 聚（腺苷二磷酸-核糖）多聚酶,effector,Apoptosis,5. Caspase抑制剂,IAP（inhibitors of apoptosis proteins)家族XIAP、c-IAP-1-2 、survivin Caspase作用的底物及人工合成的短肽底物：IL-1短肽：广谱和专一抑制剂 能阻断“Long-prodomain” 相互作用的物质 丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin) FLIPs家族MRIT(casper、I-FLICE、CFLIP),(二) 介导细胞凋亡的其他酶类,核酸内切酶(endon
11、uclease) 主要是DNase, 包括DNase 、 DNase 、NUC18等； 大多数DNase在细胞凋亡时作为caspase的底物被活化并发挥作用如CAD等； 其作用点是核小体的连接处切割DNA，产生180200bp的Ladder.,(二) 介导细胞凋亡的其他酶类,蛋白激酶(protein kinase，PK) PKC可通过与caspase相互作用影响细胞凋亡； DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK），活化后参与DNA损伤与修复，能抑制凋亡， 能被caspase-3灭活。 其他酶类： 丝氨酸蛋白酶（如粒酶B）、calpain、NOS等,二、细胞凋亡的信号传递途径,细胞凋亡的影响信号分为
12、2类： 一类为凋亡的负调控信号（抑制凋亡）； 另一类为凋亡的正调控信号（诱导凋亡）。 细胞凋亡信号转导通路的特点： 同一性：各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。 多样性：刺激因素、细胞类型、环境因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。,（一）死亡受体介导的细胞凋亡,死亡受体(death receptors, DR)：属肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族 定义：指细胞表面存在的一类能结合凋亡剌激分子，并将信号传递至胞内引起细胞凋亡的受体。 组成：胞外区（富含Cys结构域、保守）死亡结构域 (death domain, DD)DD将受体信号与胞内凋亡机制相偶联 分类：目前
13、已发现近十类CD95(Fas/Apo1)、TNFR1、TNFR2、 DR3(Apol3/Esl1)等。,“死亡结构域” (death domain, DD) 概念：是凋亡信号受体共有的、存在于胞内的诱导细胞凋亡所必需的一段高度同源的aa序列。 种类： Fas相关的死亡结构域(Fas-associated death domain，FADD)：FADD包含DD和死亡效应结构域（death effector domain, DED) TNF受体相关的死亡结构域 (TNF receptor -associated death domain，TRADD)； 受体相互作用蛋白(receptor inte
14、racting protein, RIP)（含相似的死亡结构域） 功能：DD的活化或过表达都会导致细胞凋亡.,TNF,TNF,TNF,死亡诱导信号复合体(DISC)形成,促进炎症、 免疫反应等,活化,Caspase-8,效应Caspase活化、级联放大反应,细胞凋亡,TRADD,FasL,FasL,FasL,活化,（二）线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径,m的维持，与线粒体膜通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore, MPT）部分相关； 几乎所有诱导剂引起的细胞凋亡都伴线粒体跨膜电位(m)的下降; 几乎所有的凋亡诱导因素导致MPT破坏或开放；
15、 开放的后果： m 下降、氧化磷化脱偶联、GSH耗竭、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产生等，并形成自我放大效应。,线粒体释放的凋亡诱导分子: 在多种诱导因子（如Bax过表达、UV照射）作用下， MPT开放和外膜破坏； 线粒体释放多种凋亡相关分子，如细胞色素C (cytochrome C, Cyt C)、 Smac、 AIF、Endo G Cyt C ： 释放到胞质中的Cyt C，可特异性地结合接头蛋白Apaf-1并使之寡聚化; Apaf-1借助N-端caspase 相关征募结构域（CARD）,直接募集多个caspase-9并使之活化-凋亡。,细胞毒性T淋巴细
16、胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)可通过分泌粒酶B杀伤靶细胞粒酶的特点： 粒酶（Granzyme, Gr）是CTL和NK细胞杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称； 先以酶原形式合成，受刺激后激活； 已发现5种： CrA、B 、H、M和类胰蛋白酶-2; 其中以GrB促凋亡作用最强。,（三）粒酶B介导的细胞凋亡,1.粒酶B的基本结构,活性中心：三个aa组成（His44Asp88Ser183)Ser是发挥催化作用的关键残基 最适pH：7.5 功能：切割胞浆和核中的多种底物，诱导凋亡 2. 粒酶B进入靶细胞的途径： 穿孔素（perforin, PFN)孔道模型学说 靶细胞膜表面受体介导内吞作用假说,3. 粒酶B诱导细胞凋亡的途径介导的死亡途径是多层次、多水平的，以便快速清除异常细胞； Caspase依赖的死亡通路是CrB介导细胞死亡的重要途径之一：在体外，pro-Caspase家族中，除-1外其余的都可被CrB切割活化，-10和-7是CrB的最适底物； 线粒体介导的死亡途径是另一个重要的途径：需要多种蛋白质（如Bax、Bid、Bak）参与，与线粒体膜通透性及m 有关。,
