《【生物课件】 免疫组化基本技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【生物课件】 免疫组化基本技术（123页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、免疫组化基本技术 倪 灿 荣,RCA法 IGSSIS-PCR CSA法UIP EnvisionLSAB法双PAP法 PAP法,ABC法 桥法 间接法 直接法,第一部分 组织与细胞材料的制备,内容：组织与细胞材料的取材和保存,主要内容 一、人体组织标本的取材 二、动物组织标本的取材 三、取材注意事项 四、细胞标本的准备 五、组织的固定、脱水、透明和包埋 六、切片 七、组织与细胞材料的保存,概 述 免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切
2、片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。,一、人体组织标本的取材 手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。,1.手术切除标本的取材： 抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。 组织大小：长1cm宽1cm厚0.20.3cm。,2.各种小组织的活检取材： 它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。,3.穿刺标本的取材：光镜（HE、特殊染色、IHC、ISH）电镜（透射电镜、免疫电镜）,4.尸检组织的取材 病人死亡后，一般要在数小时后
3、才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展IHC检测的关键。,二、动物组织标本的取材动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。,动物处死方法： 1.麻醉法 乙醚或4戊巴比妥静注2.空气栓塞法3.断头法4.击头法5.股动脉放血法,三、组织取材注意事项 1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。,2.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。 3.组织块的大小 厚为0.10.3cm，大小可根据需要而定 4.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的
4、，观察部位而定,5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。,6.注意包埋方向 7.边缘标记 8.保持材料的清洁 9.切除不需要的部分 10.明确编号，登记 11.骨组织还需脱钙,四、细胞材料的准备 细胞的取材和制片法： 1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定2030min。,优点：操作简单，抗原保存好 缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背 景染色。 2.穿刺吸取法,3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。 （1）常规细胞玻片制片法 （2）单核细胞分离法
5、,体液沉渣细胞学切片制作：取两只10ml试管，分别装入体液10ml，离心后留取沉渣。 滴入蛋清12滴混匀，加入固定液5ml，固定1h，离心后留取沉渣。 将试管剪开，底部1cm处，取出沉渣，用擦镜纸包好，进行常规脱水、包埋、石蜡切片。该方法可以免除大范围的阅片,又可避免漏诊, 可重复切片, 使IHC标记更为方便。,自动细胞离心涂片机制作胸腹水细胞学涂片方法。,3.制备细胞玻片应注意 （1）易脱片； （2）细胞应集中在直径0.61.0cm的圆圈内，总数105-106； （3）富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。,4.活细胞标本的制备法 培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将 （1）细胞大量
6、培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。,五、组织标本的固定 1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。,（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、 增加组织硬度、便于制片。,（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有
7、形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。,2.固定液的种类 (1)甲醛固定液 10福尔马林 10中性福尔马林 10中性缓冲福尔马林,(2)4多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液 重铬酸钾 25mg 氯化汞 10g 冰醋酸 50ml 蒸馏水 800ml,(5)Zamboni S液 多聚甲醛 20g 饱和苦味酸 150ml PB液至 1000ml (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。,(7)PLPD固定液 取PLP固定液25
8、ml，加 入2.5%重铬酸钾25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿 30ml，醋酸10ml，混均后4保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。,(10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇 类固定剂其固定原理主要是对蛋白 质的沉淀而发生固定作用。,3.固定方法的选择及注意事项 (1)大小 2cm2cm0.3cm (2)及时固定,(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反
9、比。 (4)组织固定后必须彻底冲洗。,影响固定的因素1. 温度 常规固定温度是室温(22)，某些酶的固定要求在37下进行，某些病毒则需在低温下固定。冰冻切片用丙酮固定，最佳在-20 40。2. 浓度 10%中性甲醛，4%多聚甲醛，乙醇常用95%，丙酮为原液。3.时间 固定时间要视组织块的大小，固定液的种类和浓度，固定所处的环境温度等条件而定。原则上，组织块大小与固定时间成正比。,六、组织脱水、浸蜡及包埋 1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后
10、经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。,2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。 常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。,3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油,4.原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。 在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。,5.常规石蜡包埋过程 (1)脱水：75、85乙醇，95、 乙醇，无水乙醇、。 (
11、2)透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯,(3)浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡 (4)石蜡包埋：修蜡块，标号,6.根据本实验室经验各种不同类型组织 的石蜡包埋条件 (1)大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间,75乙醇30120min，85乙醇30120min，95乙醇 2h，95乙醇 2h，95乙醇过夜，无水乙醇3060min，无水乙醇3060min，无水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可视观察结果而定），石蜡30min，石蜡12h，石蜡23h。,(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h，1h，过夜或2h，无水乙醇、和各30m
12、in，二甲苯15min, 10min，10min（肉眼观察），石蜡30min，石蜡30min，石蜡12h。,(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸 蜡时间 75乙醇30min，85乙醇1h，95乙醇1h，1h和4h或过夜，无水乙醇30min，12h和4h，二甲苯30min，30min和1h。,七、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。,1.切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。,(2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分
13、子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片丙酮5min APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。,铬矾明胶液： 铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml 甲醛明胶液： 40甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml,2.石蜡切片： 3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机),4.切片要求及注意事项： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)5260烤片18h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)编上号
14、(6)切片可在4保存数年（石蜡切片）,(7)冰冻切片需凉干后立即固定 (8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组 织需经庶糖处理24h，冰冻切片。 (9)冰冻切片固定后-80保存备用,八、组织与细胞材料的保存 1.冷冻保存： -80，-145，-198 组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。,2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，-80冻存。 3.蜡块的保存 4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。,第二部分 IHC的一些基本技术,主要内容 一、实验的设计 二、石蜡切片的脱蜡至水 三、内源性酶的消除方法 四、IHC的非特异性染色 五、抗原的暴露和修复 六、抗体的购置及注意事项 七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制 九、IHC常用缓冲液,一、实验的设计 1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。,
