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1、20. 叶绿体色素含量的测定-分光光度法,实验原理利用80%丙酮提取叶绿体色素，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是663nm、646nm和470nm。根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出丙酮提取液中叶绿体色素含量。,实验目的掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。,实验器材和试剂 1、材料：菠菜叶片 2、 用具：分光光度计、天平、研钵、漏斗、剪刀、容量瓶、烧杯、滤纸、滴管等 3、试剂：80%丙酮、石英砂和碳酸钙,实验步骤,1.叶绿体色素的提取,取新鲜菠菜叶片5克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和CaCO3,再加入80
2、%丙酮3ml,研磨成匀浆,再加80%丙酮10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用丙酮反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。,取光径1cm比色杯，注入上述叶绿素提取液,以80%丙酮注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长663、646和470nm下测定吸光度。,2.吸光度的测定,3.结果计算,依据下列丙酮提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。,计算公式 80%丙酮提取液中色素浓度的计算 Ca（叶绿素a）=12.2A663-2.81A646 Cb（叶绿素b）=20.13A646-5.03A663 CT（叶绿素）=Ca+Cb=17
3、.32A646+7.18A663 Cx.c（类胡萝卜素）=(1000A470-3.27Ca-104Cb)/229,叶绿体色素含量=,附录：722分光光度计的使用,1、选择灵敏度旋纽至3；将波长调节到600nm，打开样品室盖，打开电源开关预热20min。 2、打开样品室盖，将测定旋纽调至T（透光度），用调节旋纽0调0；盖上样品室盖，用调节旋纽100调100。 3、将空白样品放入样品槽，按上述方法调0和调100。 4、将测定旋纽调至A（吸光度），用Abs旋纽调0，测定待测样品的光密度。,作业,计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。,思考题,1. 叶绿素a、b在蓝色区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素的定量分析？为什么？ 2为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？,
