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1、基因工程技术,Jackson, Symons, and Berg (1972) generated first recombinant DNA moleculesCohen and Boyer (1973) produced first plasmid vector capable ofbeing replicated within a bacterial host,The Nobel Prize in Chemistry 1980,定义：,基因工程（gene engineering） 重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片
2、断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的应用分子克隆技术，人为地改造基因，改变生物遗传性状的系列过程，总称为基因工程。,应用：,克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产多肽产品。 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等,基因工程基本步骤：,基因工程流程示意图,构建重组分子（连接）,原料：,目的基因：研究对象 载体：目的基因的运载工具 工具酶：连接酶、限制性内切酶,目的基因片段来源：,基因组DNA（非编码序列） PCR 方
3、法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增） 通过RT-PCR 方法得到目的基因cDNA 人工合成基因片段（价钱昂贵）,目的基因来源选择：,取决于解决什么问题？基因功能研究,cDNA,RT-PCR,基因表达调控的研究,基因组DNA,PCR,PCR：,引入合适的酶切位点，一个/两个。 加保护碱基，1-3个。 加上想要的标签，如 Flag, Myc, His, HA。 启始及终止密码子。,高保真聚合酶：HF，Pfu，Probest 等。,片断的回收与纯化,载体：,载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和
4、表达。 种类：,按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、穿梭载体(shuttle vector),克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（pBR322）。表达载体(expression vecto
5、r) 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（pcDNA3）。,穿梭载体(shuttIe vector),能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体。其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。,质粒载体,具有复制起始点，这是质粒自我增殖的必要条件。 具有较小的分子量，较高的拷贝数，是一个松弛型的质粒。 具有某种选择性标记以区别转化和非转化细胞。大多是一些抗菌素抗性基因，赋予受体细胞
6、对某些抗生素的抗性，为转化子选择提供便利。（Ampr；Tetr） 具有若干限制性内切酶单一识别位点，便于外源基因插入。,是细菌染色体外能够自我复 制的双链环状 DNA 分子。,克隆载体: pBR322,特点： 分子量小，4.3kb，便于操作。 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组和非重组分子。 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停止时，它仍能继续复制。,TA 克隆,A,A,TOPO-T
7、A,原核 His-tag: pQE系列(Qiagen), pET22(Novagen) GST-tag: pGEX系列(Pharmacia),表达载体：带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件，如启 动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。,pcDNA 3系列 (Invitrogen)，,真核表达载体：大多是穿梭载体。,pFLAG-CMV系列(Sigma),DNA分子的体外连接：方法,粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接,两种情况：,（a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体易自身环化。用碱性磷酸酶(能除掉DNA两端的5 磷酸基团）处 理载体，可防止载体自身环化。,（b）目的基因和载
8、体用两种产生粘末端的限制酶切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。,碱性磷酸酶处理：,平头末端：,（1）增加连接酶的量 （连接酶对平末端DNA的Km约高于粘性末端DNA100倍 ） （2）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内 切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体 连接。如加上一个人工接头内含GAATTC序列，用 EcoRI酶切，产生EcoRI 粘性末端。,Eco R,Eco R,Eco R,连接策略：,pCMV,连接浓度：,片段与载体连接机率自身环化一般计算公式：粘性末端：载体片段含量（ng）/载体长度（kb） 1DNA片段含量（ng）/ DNA片段长度（kb） 3-
9、5平末端 1：5 10,连接反应：,10ul 体系,H2O Buffer Vector Insert ligase,14过夜,连接反应条件 连接酶的活性；DNA的纯度；载体与目的基因的比例； PH值7.2-7.8适宜；14(不高于16)过夜,连接酶：两种,DNA连接酶：连接双链中两条DNA链之间形成磷酸二酯键，封闭双螺旋骨架缺口。需要一条DNA链的3-末端具有游离的OH，另一条DNA链5-末端的磷酸基团-P，吸能反应，需ATP存在。也可做DNA修复。但不能连接两条单链DNA分子和环化的单链DNA分子。而且只能连接粘性末端。 T4 DNA连接酶：是从感染T4噬菌体的Ecoli中分离得到的一种连接
10、酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接头。用途比DNA连接酶广泛，是分子生物学研究及基因克隆中较常用的连接酶。,其他酶：末端修饰酶,末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）简称末端转移酶。在合适的反应系统中，这种酶使DNA片段平末端的3-OH加上同聚核苷酸，产生具有 poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、或poly（C）的粘性末端。 碱性磷酸酶根据DNA重组的需要，为防止两DNA片段末端之间连接，经常采用碱性磷酸酶处理，使DNA末端的5-P成为5-OH。目前采用的碱性磷酸酶有两种，即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）
11、和来源于小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高出10倍以上，而且对热敏感，便于加热使其失活。,重组子导入受体细胞：,把重组DNA导入受体细胞进行扩增.根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞（原核，真核）及选择适宜的转化或转染的方法。 受体细胞的要求：必须具备使外源DNA进行复制的能力（提供复制所需的原料）而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定。,重组子导入受体细胞：途径,转化：质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌（感受态菌）的过程 转染：噬菌体、病毒、或以它作为载体构建的重组子主动或被动被导入细胞的过程。 感染：以
12、病毒为载体的重组子，在体外包装成具有感染力的病毒颗粒，通过感染受体细胞，然后整合到受体细胞基因组上。,转化,受体细胞：大肠杆菌，基因工程中最常用的宿主细胞 转化机理：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变。转化效率：只有很少比例的细胞有能力掺入质粒DNA转化时大约在1000个DNA分子中，只有一个DNA分子获得成功。一般每微克完整的pBR322DNA产生105-107 转化细胞,感受态菌制备,感受态：细菌细胞处于一个容易吸收外源DNA状态，这种状态的细菌称为感受态菌。 氯化钙法： 氯化镁法： 电转法：,氯化钙法：原理,快速生长的细菌用低渗低浓(50 100mM) 的氯化钙（Ca
13、Cl2)处理，使细胞肿胀成球形 加入质粒后，即于细胞表面形成抗DNAase的羟基-磷酸钙复合物 经42热休克后，复合物被细胞吸收。 非选择性培养基上生长数小时，球状细胞复原开始增殖,抗生素基因表达。,重组子的筛选：,根据重组体的表型筛选,抗性基因插入失活：生存或是毁灭？,互补现象：蓝白斑筛选,LacZ-受体菌编码 半乳糖苷酶羧基端（C 端）片断,载体编码一半乳糖 苷酶氨基端（N端）的肽,插入失活：,互补现象： 蓝白斑筛选,4290s,+900ul LB,37 45min,3*1ml菌液,沉淀+0.5mlCaCl2,6000rpm 5min,冰浴30min,6000rpm 5min,沉淀+0.1
14、mlCaCl2,+10 ul 连接产物,+10 ulPBR322,阴性对照,A+T,A+T,阳性对照,Amp,Tet,冰浴30min,阳性克隆的鉴定：,挑菌落，小抽质粒，电泳,菌落PCR,94 10 min 30s 40s 1min 72 8min4 hold,X 30,碱裂解法,碱裂解法,原理：pH值介于12.0-12.5范围内，线形的DNA和环状的质粒DNA变性，中间的氢键短裂，线状DNA变性后互相分开，而环状分子双螺旋主链骨架彼此盘绕，互补两条链紧密合在一起。变性处理的质粒DNA和染色体DNA通过致冷或恢复中性pH，开始复性。环状分子由于本身合在一起，所以复性迅速而准确。线状DNA变性时
15、彼此分开，复性慢而不准确，互相之间聚集形成较大的网状结构，离心后，与变性蛋白质和RNA一道沉淀下来，上清液中留存下的主要是环状DNA分子和少量的可溶性蛋白质和部分的RNA，这些可溶性蛋白质和部分的RNA可 通过苯酚抽提及RNA酶处理去除。,试剂作用：,溶液I-葡萄糖、Tris.HCL、EDTA。低渗，细胞变的脆弱而易于裂解，EDTA螯和金属离子，防止DNA降解。 溶液II- NaOH、SDS。 NaOH使细胞裂解，释放出质粒DNA和染色体DNA。 溶液III-醋酸钾。降低反应pH值，起中和作用。,Protocol:,1ml菌液,沉淀+S1 250ul,12000rpm 1min,彻底重悬,+S
16、2 250ul,+S3 350ul,上清转移至回收柱,+500ul W1,12000rpm 10min,轻柔颠倒4-6次 5min内,颠倒混匀,12000rpm 1min 弃去废液,12000rpm 1min 弃去废液,+700ul W2,+700ul W2,12000rpm 1min 弃去废液,12000rpm 1min,12000rpm 1min 弃去废液,弃去废液， 柱转移至收集管,+50ulTE,12000rpm 1min,室温静止1min,质粒样品,初步鉴定:,酶切体系：pBR322 pBR322+弓形虫ddH2O: 7ul 7ul 10*bf: 2ul 2ulBSA: 2ul 2ulBamH I: 1ul 1ulDNA: 8ul 8ul 37 1.5hr 1%agarose,
