细胞的冻存、复苏

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1、细胞冻存与复苏,上海日泰生物部 江贤木 2012年11月,细胞的冻存和复苏的必要性,1.细胞冻存,细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化；二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系转给其他使用者。,2.细胞复苏,在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。,细胞冻存复苏的原理,为使细胞复苏时存活率最高 最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的损伤。A) 缓慢冷冻 B) 用亲水的低温保护剂排除水分 C)在尽可能低的温度保存细胞 D)快速复

2、苏,细胞的冻存与复苏关键因素,要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。,冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：515甘油或二甲基亚砜（DMSO） 冷冻保存温度：196 （液氮）,对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活性好的冻存物。 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。 具有渗透性的冷冻保护剂。一般是一些小分子的物质，可以渗透到细胞内。 非渗透性冷冻保护剂。一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。,冷冻保护剂的重要性,冷冻保护剂的重要性,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器

3、脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞损伤甚至死亡。 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，在缓慢冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，细胞内冰晶减少，从而减少对细胞的损伤。,冻存的原则：慢冻,冻存液配制,冻存的原则：慢冻,细胞悬液制备,1）取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（2106 5 106细胞/ml) 2）加入1.5ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称、批号、代次和冷冻日期，并做好登记。,冻存和复苏的原

4、则：慢冻快融,慢冻程序,标准程序：当温度在-25 以上时， 12 /min（4 冰箱存放30min）当温度达-25 以下时， 510 /min（ -20 冰箱存放1.5-2h ） 当温度达-80时，可迅速放入液氮中（ -80 冰箱存放4-12h）转入液氮罐，注意登记！ 简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐内液体上方，30分钟后，立即投人液氮中。,冻存的原则：慢冻,复苏的原则：快融,复苏方法,冻存细胞的复苏以快速融化为原则。尽快度过冰晶期复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在370C水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。,复苏的原则：快融,复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，不断搅拌使其融化（1分钟左右）。 （2）将细胞悬液吸到含有新鲜生长液的方瓶中，用电动移液器吹打均匀后置于，4-6小时后应换液。,