《肺动脉平滑肌细胞增殖中作用研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肺动脉平滑肌细胞增殖中作用研究（76页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学博士学位论文蛋白激酶C、碱性成纤维细胞生长因子在吸烟促进肺动脉平滑肌 细胞增殖中作用的研究姓名：胡静申请学位级别：博士专业：内科学（呼吸内科）指导教师：徐永健20070401华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 I蛋白激酶蛋白激酶 C、 碱性成纤维细胞生长因子在吸烟促进肺动脉平滑肌细胞增殖中作用的研究、 碱性成纤维细胞生长因子在吸烟促进肺动脉平滑肌细胞增殖中作用的研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科 博士研究生 胡静 博士生导师 徐永健华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科 博士研究生 胡静 博士生导师 徐永健
2、 中中 文文 摘摘 要要 研究背景研究背景 吸烟不仅可引起慢性支气管炎、慢性阻塞性肺气肿，而且还可进一步导致肺动脉高压和慢性肺源性心脏病。肺动脉高压与慢性阻塞性肺病（COPD）患者的临床预后恶化、生存率降低密切相关，目前尚缺乏特异而有效的治疗。既往对 COPD 合并肺动脉高压发病机制的研究多集中于缺氧性肺血管收缩和缺氧性肺血管重建。近年发现吸烟可直接导致肺血管重建、参与肺动脉高压的形成，其主要机制可能是吸烟促进肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的增殖，但具体机制尚不清楚。细胞内信号转导通路的激活、生长因子的产生和释放在吸烟致 PASMC 增殖中可能起着重要作用。 蛋白激酶 C（PKC）是细胞内生物
3、信号转导途径中的一类关键酶，参与调控血管平滑肌细胞的增殖、 凋亡、 分化、 迁移和基因表达等。 我们实验室以往的研究发现 PKC的活化，PKC 亚型的表达上调在低氧致 PASMC 增殖中起重要作用。前期研究工作还发现无论是慢性吸烟大鼠，还是吸烟非 COPD 患者和吸烟 COPD 患者其肺小动脉PKC- mRNA 及蛋白质的表达都增加，提示 PKC-可能参与了慢性吸烟所致的肺血管重建。但 PKC 特别是 PKC-在吸烟对 PASMC 增殖的影响中所起的作用有待在细胞培养水平进一步予以研究。 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为一种生长因子和丝裂原，可促进肺动脉内皮细胞增殖，外膜成纤维细胞生长，
4、强烈地刺激中膜平滑肌细胞增殖、迁移、合成分泌胶原和纤维连接蛋白等细胞外基质，在低氧和野百合碱所致的肺血管重建和肺动脉华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 II高压中发挥着重要作用。有研究发现，在吸烟合并 COPD 的患者中，bFGF 在肺小动脉平滑肌细胞的表达增加，可能参与了吸烟所致的肺血管重建，但目前尚无相关的动物在体实验和离体实验的研究。 本研究从PKC信号转导通路和bFGF两个方面探讨吸烟致PASMC增生和肺血管重建的可能机制，为 COPD 合并肺动脉高压的发病机制研究和防治提供基础资料。 第一部分第一部分 香烟烟雾提取物对肺动脉平
5、滑肌细胞增殖的影响及蛋白激酶香烟烟雾提取物对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及蛋白激酶C 相关作用的研究相关作用的研究 目的：目的： 探讨香烟烟雾提取物（CSE）对体外培养的大鼠和人 PASMC 增殖的影响及PKC 信号转导途径在其中所起的作用。 方法：方法： 组织块法培养正常 Wistar 大鼠 PASMC，复苏培养人 PASMC 细胞系。 （1）不同浓度的 CSE 作用于 PASMC 24h，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测 PASMC 增殖，台盼蓝排斥法检测活细胞率。 （2）PASMC 与 PKC 激活剂 12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯 （PMA） 预孵育 24h 下调 PKC 或与 PK
6、C 抑制剂马来酰亚胺甲磺酸盐 （Ro31-8220）预孵育 30min 然后暴露于 5%CSE，MTT 法、流式细胞术和增殖细胞核抗原（PCNA）染色等方法观察细胞增殖的变化。 （3）5%CSE 作用 PASMC 24h，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和 Western Blot 分别检测 PKC- mRNA 和蛋白质表达量的变化。免疫荧光细胞化学及激光共聚焦扫描检测大鼠 PASMC 内 PKC-的分布。（4） 大鼠 PASMC暴露于 5%CSE 前 6h 转染 PKC-的反义寡核苷酸，观察 PKC-蛋白表达量和细胞增殖的变化。 结果：结果： （1） 20%和 30%CSE 对 PASM
7、C 有细胞毒性作用， 5%和 10%CSE 不影响 PASMC的活细胞率。 5%CSE 组 PASMC MTT 的吸光度 （A） 值较对照组明显增高。（2） 5%CSE组 PASMC 的 MTT A 值、增殖指数（PI） 、S 期细胞分数（SPF）和 PCNA 染色平均光密度值增高，与对照组比较差异有统计学意义（P200m的肺血管其平滑肌 FGF-1 和 FGFR-1 表达增加，提示 FGFFGFR-1 系统可能参与了吸烟合并 COPD 患者的肺血管重建。 4.4 炎性细胞因子炎性细胞因子 吸烟的人和动物肺内都有大量炎症细胞如中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的侵润，这些炎症细胞所产生和释放的多种
8、炎性细胞因子如 TNF 和白介素是肺血管重建的重要因素。 5. 肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡 肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的平衡在维持肺血管正常的结构和功能中起着重要作用。肺动脉平滑肌细胞增殖增加，凋亡减少导致肺血管重建、肺动脉管腔狭窄、肺血管阻力增加、肺动脉高压形成。 据报道32，不吸烟无 COPD 的人肺小动脉肺动脉平滑肌细胞中可见少量 PCNA阳性细胞，正常吸烟者可见较多的 PCNA 阳性细胞，吸烟合并 COPD 患者可见大量PCNA 阳性细胞。也有文献报道，吸烟 3 月大鼠较大的肺动脉（直径450m）中成纤维细胞、胶原束和弹力板增加，但平滑肌细胞减少了42。急
9、性吸烟可导致豚鼠较小的邻近细支气管的肌性动脉和肺泡管旁的部分肌型动脉血管壁细胞增殖，此增殖效应在慢性吸烟的豚鼠可持续数月之久，肺泡管旁的小血管比肌性动脉对烟雾的增殖反应更明显43。在大鼠离体肺片模型中，谷胱甘肽可显著抑制烟雾所致的细胞增殖44，说明氧化剂在吸烟引起的细胞增殖中起重要作用。尼古丁亦可通过增加 bFGF 和 TGF-的产生诱导牛动脉平滑肌细胞增殖45。 有关肺血管重建中平滑肌细胞凋亡的研究较少。凋亡的减少将有利于肺血管的重建。但有研究表明，吸烟大鼠肺动脉平滑肌细胞细胞的凋亡也有所增加，与增殖同时华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论
10、 文 57存在，但增殖高于凋亡，即增殖过度，凋亡不足，增殖和凋亡的平衡失调导致了肺血管重建32。诱导过度生长增殖的肺动脉平滑肌细胞凋亡可阻止肺血管中膜肥厚的形成，而抑制肺动脉平滑肌细胞的凋亡则使中膜肥厚加重46。3-羟基 3-甲基戊二酰辅酶 A (3-hydroxy-3-methylglutary coenzyme A, HMG CoA)还原酶抑制剂辛伐他汀可通过诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡而减轻吸烟大鼠的肺动脉高压47。 关于凋亡在吸烟所致肺血管重建中的作用的研究在今后将得到更多的重视，对吸烟引起的肺动脉高压的防治具有重要意义。 三、吸烟致肺血管重建的后果三、吸烟致肺血管重建的后果 肺血管重建有
11、几方面的生理学的影响。首先，肺肌性动脉中膜平滑肌的增加，外周小动脉的新肌化，将导致管壁张力增加；其次，细胞外基质特别是胶原在肺血管过量的沉积将导致肺血管顺应性的降低，正常肺血管床的高顺应性可保证心输出量增加时肺动脉压只轻度上升，但这种能力在肺血管重建时受到了损害，将导致右心室压的增加；最后，根据 Poiseuilles 定律，中膜肥厚和内膜增生所致肺动脉管腔的狭窄会导致肺血管阻力明显增加，从而引起肺动脉压力增加。 四、肺血管重建在吸烟所致肺动脉高压的治疗中的意义四、肺血管重建在吸烟所致肺动脉高压的治疗中的意义 肺血管重建使传统的 COPD 合并肺动脉高压治疗氧疗和肺血管扩张剂疗效较差，从而要求
12、针对肺血管重建进行治疗48。动物实验资料中肺血管重建的减轻几乎都伴随着肺动脉压或肺血管阻力的降低，支持肺血管重建是治疗肺动脉高压正确的靶点。前列腺素类药物、内皮素受体拮抗剂以及磷酸二酯酶抑制剂等已用于治疗肺动脉高压(主要为特发性肺动脉高压)，患者存活率、症状 (呼吸困难)、生活质量以及肺血流动力学等均有改善。COPD 合并肺动脉高压的患者也存在与特发性肺动脉高压类似的血管病变，但因这些抗增殖药物价格较贵所以在 COPD 合并严重肺动脉高压的患者，可试用上述药物治疗。血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、内皮素转化酶抑制剂、钙离子拮抗剂、HMG- CoA 还原酶抑制剂、肝素、丝氨酸弹性蛋
13、白酶抑制剂等药物因其抗增殖作用将成为今后治疗研究的重点。由于肺血管重建和肺动华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 58脉高压的发病机制复杂，有多种因素同时起作用，因此成功的治疗可能需要多种药物的联合应用。 五、结语五、结语 传统观点认为肺动脉高压由缺氧和或肺气肿造成的肺血管床的毁损引起，近些年的研究证实了香烟对肺血管的直接作用造成的肺血管重建在肺动脉高压发病机制中的重要地位，对今后肺动脉高压的防治具有深远的影响。 参考文献参考文献 1. Weitzenblum E, Sautegeau A, Ehrhart M, et al. Long-
14、term oxygen therapy can reverse the progression of pulmonary hypertension in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am Rev Respir Dis, 1985, 131(4): 493-8. 2. Scharf SM, Iqbal M, Keller C, et al. Hemodynamic characterization of patients with severe emphysema. Am J Respir Crit Care Med
15、2002, 166: 314322. 3. Barbera JA, Riverola A, Roca J, et al. Pulmonary vascular abnormalities and ventilation-perfusion relationships in mild chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med, 1994, 149: 423429. 4. Wright JL, Petty TL, Thurlbeck WM. Analysis of the structure of the mu
16、scular pulmonary arteries in patients with pulmonary hypertension and COPD: National Institutes of Health Nocturnal Oxygen Therapy Trial. Lung, 1992, 170:10924. 5. Jeffery TK, Wanstall JC. Pulmonary vascular remodeling: a target for therapeutic intervention in pulmonary hypertension. Pharmacol Ther, 2001, 92(1): 1-20. 6. Magee F, Wright JL, Wiggs BR, et al. Pulmonary vascular structure and function in chronic obstructive pulmonary disease. Th
