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1、浙江大学硕士学位论文联合应用布地奈德和孟鲁司特对哮喘大鼠气道炎症的影响姓名：崔巍申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：沈华浩2001.5.1联合应用布地奈德和孟鲁司特对哮喘大鼠气道炎瘗的影响_ ，_ _ ，_ 一浙江大学医学院附属第二医院内科学( 呼吸系病)硕士研究生崔巍导师沈华浩教授中文摘要支气管哮喘从本质上讲是一种气道慢性炎症性疾病，O O S 在哮喘患者气道内的浸润是哮喘的重要特征，也作为哮喘的标志物。近年来，白三烯在哮喘发病中的作用和地位受到了越来越多的关注。白三烯的合成与释放和肥大细胞、e O $ 密切相关，而这两种细胞正是与哮喘有关的关键细胞。抗炎治疗近年来被认为是最重要的治疗措
2、施。局部使用激素是目前最有效的抗炎治疗药物。抗白三烯药物是近年来较为活跃的哮喘治疗新措施，本研究以哮喘动物模型为基础，试图证明白三烯受体拮抗剂可以减少表面激素的用量而达到治疗哮喘的效果。 实验材料与方法( 实验动物S p r a g u eD a w l e y 大鼠，约1 3 0 克，雄性，随机分为以下几组：布地奈德处理组( b u d e s o n i d e ，B U D ) 、孟鲁司特处理组( m o n t e l u l ( a s t ，M ) 、1 2 布地奈德+ 1 2 孟鲁司特处理组( I 2 B U D + I 2 M ) 、抗原致敏激发组( o v a l b u m
3、 i n ，O V A ) 、正常对照组( N o r m a lC o n t r o l ，N C ) 。实验方法及步骤以生理盐水l m l 、卵白蛋白3 0 m g 、氢氧化铝凝胶l O O m g 混悬液配成的致敏剂致敏B U D 组、M 组、1 2 B U D + I 2 M 组和O V A组，正常对照组以生理盐水l m l 、氢氧化铝凝胶1 0 0 m g 混悬液处理。从致敏后第8 天起，予孟鲁司特每天灌胃一次共7 天，从致敏后第1 l 天起，予B U D 每天两次雾化吸入共4 天。第1 4 天予O V A 雾化攻击，第1 5 天处死各组大鼠，分别留取血、肺泡灌洗液、骨髓涂片计数白
4、细胞总数和e o s 数，各标本离心后取上清液存于- 2 0 待测细胞因子I L 5 、I F N 吖。最后取下肺组织固定于1 0 中性甲醛中作肺切片。数据统计采用S P S S1 0 0 统计软件进行分析。所得结果以均数标准差( ；s d ) 表示。各组实验数据先经z 2 检验明确符合正态分布后，再行方差齐性检验，若方差齐。则采用单因素方差分析( O n e W a yA N O V A ) ，多重比较采用L S D 法。若方差不齐则进一步进行非参检验中的M a n n W h i t n e y 分析，取P 0 0 5 ) 无显著性差异。与N C 组相比，M 组( P O 0 5 ) 和1
5、 2 B u D + l ，2 M 组( P O 0 5 ) 无显著性差异。E o s ：与O V A 组相比，B U D 组( P O 0 5 )无显著性差异。与N C 组相比，M 组( P 0 0 5 ) 和I 2 B U D + I 2 M 组( P 0 0 5 ) 无显著性差异。e o s 在各组之间经方差齐性检验后证明方差不齐，故用非参检验中的15M a n n W h i t n e y 检验，结果显示：与O V A 组相比，B U D 组( P L T C 4 L T E 4 。e y s L T l 的选择性拮抗剂如m o n t e l u k a s t 、z a f i
6、r l u k a s t 、p r a n l u k a s t 能非常有效地抑$ 0 L T D 4 的结合。大量c y s L T lm R N A 在脾、外周血白细胞、肺巨噬细胞和气道平滑肌中被发现。此受体基因位于x 染色体上。2 2c y s L T 2 受体至今对e y s L T 2 受体的情况知之甚少，文献报道的结果有些大相径庭。已知c y s L T 2 受体与c y s L T l 一起出现在豚鼠的肺和气管以及大鼠的肺组织中。B A Yu 9 7 7 3 在体外可抑制由u D t 诱导的支气管收缩，但在人体中作用非常弱【”I ，因此，人类支气管中是否存在c y s L T
7、 2 受体尚有争议。最近，在爪赡属卵母细胞和H E K2 9 3 细胞中克隆t 出c y s L T 2 受体，同样也和c a 2 +内流加速相偶联，X C L T C 4 和L T D 4 的敏感性相同1 2 6 1 。这一现象不能被经典的c y s L T ，受体拮抗剂所抑制。大量e y s L T 2m R N A 在肺巨噬细胞、气道平滑肌、人类心脏、肾上腺髓质细胞、外周血白细胞和大脑以及胎盘、脾 中被发现。此受体基断1 3 q 1 4 染色体上，这一区域与特应症哮喘有关 2 6 1 。2 3c y s L T 3 受体这一类c y s L T 受体对经典的拮抗剂和B A Yu 9 7
8、7 3 都不敏感，可在豚鼠和人类的肺实质中发现，因此被命名为c y s L ，T 3 受体。【对气道功能影响】1 气道平滑肌1 1 气道平滑肌张力c y s L T s 最初被人们所认识的作用就是可引起气管平滑肌收缩，甚至在其结构被确定以前，即被称为S R S A 之前。在人类和动物的研究中，L T D 4 的作用强度比组胺大1 0 0 0 倍左右。而三种L T s 作用强弱不太清楚，早先的研究认为L T E 4 和它的前体强度相当。而最近的一系列研究表明，L T E 4 的作用比前两种要弱，而前两种L T s ( L T C 4 、L T D 4 ) 的作用则相当 2 7 1 。c y s
9、L T s 攻击后，人类支气管和肺实质都会发生收缩反应。体内实验证实，无论是哮喘病人 2 8 1 或健康人吸入c y s L T s 后都会出现支气管收缩现象。1 2 支气管高反应性L T E 。可明显引起豚鼠和人气管对组胺的高反应性，而L T D 4 无此作用。哮喘病人对L T E 4 存在高反应性，这种高反应性比组胺和甲酰胆碱所引起的高反应性弱，L T D 4 对哮喘病人无作用。某些c y s L T s 拮抗剂能够抑制甲酰胆碱引起的高反应性”I ，提示内源性c y s L T s 可能在其中扮演了一定的角色。一些证据表明，c y s L T s 在气道高反应性中扮演了重要角色。白三烯拮抗
10、剂作为一类能够抑制白三烯形成或作用的药物而应用于哮喘的治疗，并取得了显著的疗效，反过来也说明白三烯的释放是哮喘病气流阻塞和气道炎症的最终共同通路之一。1 3 气道平滑肌重建L T D a 与大鼠气道平滑肌细胞重建的调制有关，即可以引起气道重建。M K 一5 7 1 可抑制O V A 致敏大鼠的气道平滑肌增生1 3 3 J 。新近有证据表明在人类中，L T D 4 与诱导支气管细胞重建有关。事实上，在人类气道平滑肌培养时，L T D 。在上皮生长因子诱导的气道重建中起重要作用【”I 。有趣的是，这种作用可以被S K F l 0 4 3 5 3 或O N O 1 0 7 8 所拮抗，而不能被I C
11、 I2 0 4 2 1 9 所抑制，提示这种作用可能与c y s L T l 受体无关。L T B 4 不会影响气道张力，也与气道平滑肌细胞重建无关。2 对血管的影响2 1 血管平滑肌张力c y s L T s 对人类肺血管的作用非常复杂。现有的研究表明，肺静脉平滑肌细胞的c y s L T 2 受体激活能直接引起血管收缩【3 5 】。而先前的研究表明肺动脉、肺静脉对L T D 。都会产生反射，这种反射有赖于内皮细胞的完整性和c y s L T s 受体的介导。进一步研究提示静脉内皮还有一种参与平滑肌收缩的受体，通过某一种尚未确定的因子的释放起作用。与前一类受体不同的是，此受体对经典的拮抗剂敏
12、感，因此属于c y s L T 一类。2 2 血管通透性L T D 4 可以B 起豚鼠气道内渗出增加，此作用强于组胺而弱于血小板激活因子( P A F ) 。体内静脉通透性以及血浆渗出的增加可能是L T B 4和c y s L T s 协同作用的结果。L T B t 作为一种强力的趋化物质参与了白细胞的迁移、滚动和黏附1 3 ”，白细胞靠近血管壁后使得L T A 。很容易地从其前体传递至内皮细胞中，继而导致了L T C a 的大量合成。c y s L T s 使内皮细胞连接处的缝隙开放，导致通透性增强。3 分泌功能体外实验证实L T D 4 能够强有力地刺激人类气道粘膜移植物的粘液分泌l “。
13、体内实验证实吸入L T C 4 或L T D 4 都能在豚鼠、猫和狗中引起促分泌的作用。此作用由c y s L T l 受体介导，因为可以被经典的拮抗剂所灭活。L T D 。能够减慢绵羊气道的粘液运输【3 9 】，抑制人呼吸道纤毛运动，所以可以使呼吸道粘液增加。4 对神经系统的影响在豚鼠中，c y s L T s 可以刺激C 传入神经纤维而影响肺功能。L T D 4能够促使豚鼠气道中的C 纤维去极化以及P 物质或其它速激肽的释放，因此，c y s L T s 拮抗剂能够抑制由速激肽介导的迷走神经兴奋而引起的支气管收缩和血浆渗出。如果事先给予辣椒素治疗，就可抑制由L T D 4 诱发的气道对组胺
14、的高反应性1 4 “，而辣椒素是公认的可以破坏神经末梢含有速激肽的感觉神经元的物质。但到目前为止尚无证据证实人类中c y s L T s由类似的神经元调制作用。5 对炎性细胞的作用5 1L T B 4L T B 4 主要影响中心粒细胞，具有刺激中心粒细胞的趋化作用，使中心粒细胞容易穿过血管上皮，增强其活性并使中心粒细胞脱颗粒并释放出各种介质、酶、超氧化物，与炎性疼痛也有关。L T 目从气管外移入可使肺泡灌洗液中的总细胞数增加，使中心粒细胞移入肺中后者激活后产生炎症脚1 。L T B 不仅能作用于中心粒细胞，还能作用于其它细胞，比如通过刺激单核细胞使I L 6 增加。气管内灌入L T B 。能使
15、支气管肺泡灌洗液中的细胞总数增加，与生理盐水对照组相比，L T B 4 能够显著增加中心粒细胞的总数和百分比。尽管巨噬细胞的绝对数增加不多，但其百分比仍然会增高。所以L T B 4 能够促使中心粒细胞迁移入肺，并使其活性增强而产生炎症。除了炎性介质能促进L T B 4 的产生，还有其他很多因素能使其增加。将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( G M - G S F ) 加入到中心粒细胞中通过H m l p 的作用能使L T B 4 轻度上升，但用z y m o s a n 刺激后L T B 4会增加1 0 倍。这揭示了重要的一点：L T s 的数量和许多因素有关，包括暴露于细胞因子和在炎症反应中产生
16、的前炎性介质，以及最终刺激其释放颗粒的活性物质。5 2c y s L T s近年来，人们发现c y s L T s 具有强力的致炎症作用。在豚鼠中，c y s L T s可引起气道e o s 募集。在豚鼠m i s n , t 删的实验中，过敏原诱导所引起的e O S 募集现象可以被经典的c y s L T s 拮抗剂所抑制，因此，这很可能是通过c y s L T l 受体起作用的。人吸入L T E 4 后也会出现嗜酸细胞的气道募集现象，吸入L T D 4 后引起诱导痰中嗜酸细胞数量增加。根据这种现象，c y s L T j拮抗剂能够抑制由于吸入过敏原引起的炎性细胞浸润，也能抑制慢性哮喘病人痰液和外周血中的嗜酸细胞增高现象1 4 ”。【在哮喘中的作用】由充分的证据表明，c y s L T s 在哮喘时增高，尤其是当病情加重或受到过敏原刺激时。尿液中L T E 4 水平是一个稳定的表示身体中c y s L T s 总量的指标，急性重症哮喘患者2
