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1、 1硕士学位论文 论文题目 小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶的制备及其 对肝组织损伤修复的影响 研 究 生 姓 名 武 龙 指导教师姓名 周丁华 专 业 名 称 外科学 研 究 方 向 肝胆外科学 论文提交日期 2015 年 3 月 6 日 小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶的制备及其对肝组织损伤修复的影响 中文摘要 I小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶的制备及其对肝组织损伤修复的影响 中文摘要 研究背景： 小肠黏膜下层 (small intestinal submucosa, SIS）细胞外基质（extracellular matrix, ECM）是将小肠去除浆膜层、肌层及黏膜层，以及一系列加工和消毒处理后
2、，获得的一种不含细胞的细胞外基质1。SIS是一种理想的组织工程学生物材料，在机体组织修复方面具有以下三个方面的生物学优势：1. 具有组织相容性，SIS主要由、型胶原蛋白构成，并含有丰富的纤维连接蛋白及生长因子，即使经过一系列加工处理后SIS仍还有这些生长因子。如成纤维细胞生长因子-2、转移生长因子-、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子等,这些物质均为正常细胞外基质的成分。其中型胶原蛋白及纤维连接蛋白均可于细胞膜特异性结合， 并激活细胞传导通路促进细胞的粘附，而其他各种生长因子也可以刺激细胞增殖。因此，SIS不仅能为宿主细胞提供较佳黏附和迁移的自然环境，还能很快与宿主组织结合，促进血管生成，恢
3、复组织功能。2. 具有免疫原性和安全性，经过机械法和化学法联合处理的SIS不含细胞，其携带病原体的概率很低，而且其免疫原性弱，即使异种移植后亦不产生排斥反应。SIS经消毒处理后， 所含有的各种组分不会丢失或失活， 超微结构及机械特性无明显改变。因此，经消毒处理后SIS具有较高的安全性。同时SarikayaA等2指出SIS浸出液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制作用，可以抑制细菌的生长。3. 具有生物力学性能，小肠黏膜下层是一种非线性材料，在纵轴方向（无论是否刨开管壁）的抗拉伸强度相当于肌腱和韧带组织的1/7到1/4。SIS作为体内组织工程的材料，具有适当的机械特性，能承受周围组织压力，为再生
4、细胞提供足够的生长空间。因为其良好的生物学优势，SIS已经广泛应用于现代生物材料和组织工程医学领域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬脑膜修补、血管重建、修复部分或全层皮肤损伤等3。目前关于SIS在肝脏组织损伤修复方面的研究较少，但其具有较大的研究价值和应用潜力。因此，本研中文摘要 小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶的制备及其对肝组织损伤修复的影响 II究使用猪小肠自制小肠黏膜下层细胞外基质，通过制备猪小肠黏膜下层（SIS）细胞外基质水凝胶，注射至由四氯化碳（CCL4）诱导肝损伤的损伤部位，以研究SIS细胞外基质水凝胶材料对化学性肝损伤的修复作用。通过探讨注射性SIS细胞外基质水凝胶材料治疗化学性肝损伤的
5、可行性，为临床上针对急、慢性肝损伤的修复和治疗提供依据和新的方法。 方法： 1. 取新鲜猪小肠组织， 运用SDS脱细胞和酶消化方法， 制备小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶； 利用H Cell-free effect matrix material with H And test the temperature of the water gel materials produced by the sensitivity; Determined by MTT method to detect water gel material biocompatibility of human normal liv
6、er cells. 2. Cultivate people LO2 normal liver cells, were divided into normal control group, carbon tetrachloride CCL4 injury group, hydrogel CCL4 damaged cells, using flow cytometry to test each cell apoptosis, EdU cell proliferation staining method to detect each cell proliferation, cell culture
7、supernatant ELISA method to detect the groups in bEGF, VEGF and NGF plays, IL - 4, the change of IL - 6, IL - 8 content, to detect homemade small intestine hydrogel matrix of CCL4 damage of liver cell repair function. 3. Use by peritoneal injection of carbon tetrachloride method for 3 months in a ro
8、w, C57/BL chemical liver injury in mice model was established. Under ultrasound guidance, with 31g needle homemade small intestinal mucosal damage liver subcapsular matrix hydrogel injection to. Collect the serum and liver tissue of mice after processing, SIS hydrogel on laboratory mice serum albumi
9、n (propagated), alanine aminotransferase (ALT), aspartate transaminase (AST), and the influence of liver tissue pathological changes. Results: Through SDS after treatment and enzyme digestion method, H And EdU detection method found small intestine extracellular matrix hydrogel materials can promote
10、 the injury of liver cell proliferation induced by CCL4; ELISA to detect small intestine extracellular matrix hydrogel materials can promote the liver cell culture environment bEGF, VEGF and NGF plays cytokine levels, and reduce proinflammatory factor the production of IL-6, IL-8, anti-inflammatory
11、factor and increase production of IL-4; Using CCL4 to injury C57/BL mice liver model was established, successful under ultrasound guidance will be homemade small intestinal mucosal damage liver subcapsular matrix hydrogel injection to, after tests found water gel treatment group of a marked increase
12、 in the mice serum propagated, and the content of ALT and AST, ALT decreased significantly, while the H Hydrogel; Temperature sensitivity; LO2 liver cell; Liver function Written by: WU Long Supervised by: ZHOU Dinghua 目 录 前 言.1 第一章 温敏性小肠细胞外基质水凝胶制备.3 第二章 小肠细胞外基质水凝胶对肝细胞增殖、凋亡的影响.9 第三章 高频超声引导下注射温敏性小肠水凝胶
13、对CCL4致肝损伤小鼠的影响20 全文结论26 参考文献27 综 述31 在校期间科研情况46 致 谢47 个人简介48 小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶的制备及其对肝组织损伤修复的影响 前 言 1前 言 组织工程学也被称为再生医学，是指利用生物活性物质，通过体外培养和构建的方法，再造或修复器官及组织的技术4。目前组织工程已经应用到骨、软骨、皮肤、肾、肝、肌肉、乳房等组织器官5。随着生物医学材料的进步，肝细胞的应用，细胞因子和转化因子的应用，特别是利用物理或化学工程改造细胞外基质，使细胞和生物活性分子材料之间更佳组合，组织工程医学有了快速进展6。而目前组织工程遇到的难题就是寻找具有最佳性的生物医用
14、材料修复更复杂的组织以及有效利用实验室研究的生物材料进行移植并保证其稳定性。 理想的组织工程生物材料需要具有良好的生物相容性， 并适合于种子细胞在材料上的黏附和增殖生长7。生物材料是指以医疗为目的，用于与活组织接触以形成功能性的无生命材料包括具有生物相容性或生物降解性材料。 生物相容性是作为生物材料的重要标准包括血液相容性和组织相容性8。血液相容性是指材料和血液接触后，不引起血浆蛋白的变性，不会导致血液凝固和血栓；组织相容性是指材料与生物活体组织及体液接触后，不引起细胞、组织功能的下降，不发生炎症、癌变以及排异反应9。肝移植目前是公认的治疗急慢性肝功能衰竭等终末期肝病的唯一可治愈手段， 但是由
15、于供体资源少，费用贵，需要服用免疫抑制剂及并发症等都限制了其临床应用有效性10。 但随着生物材料组织工程的发展和肝脏细胞强大的再生能力， 肝脏组织工程学得到快速发展，即利用生物材料建立细胞与生物材料的三维空间复合体，形成具有生命力的活体组织，用以对病态损伤肝脏组织进行形态、结构和功能的重建修复，并实现永久性替代11。 水凝胶（hydrogel）是指一类具有亲水基团，能够被水溶胀但不溶于水具有三维网络结构的聚合物。 水凝胶对外界环境的细微变化能够做出快速反应并具有较好的生物相容性，因此，水凝胶已被作为医药控制释放材料应用于医学领域12。而温度敏感性水凝胶（temperature sensitiv
16、ity hydrogel）又称为温固化水凝胶，当外界温度超过相变温度时，材料黏度会快速增高，由液态变成凝胶态，对于生物材料中细胞因子和药物的控制缓释具有重要应用价值13。 温度敏感性水凝胶已经取得了较大成功， 并在生前 言 小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶的制备及其对肝组织损伤修复的影响 2物医用材料中得到应用。但关于水凝胶材料应用过程中与组织细胞粘附，与细胞的分化和增殖、细胞凋亡影响、细胞毒性、蛋白因子吸附、生物排异性等问题仍是研究的热点。 急、慢性肝组织损伤疾病造成肝衰竭目前仍主要依靠肝移植治疗，在临床上受到较多的限制。利用体内植入肝组织工程材料，促进肝细胞再生治疗，为细胞提供较好的三维生长支架，以促进肝细胞生长，从而形成具有特定功能的新生组织。因此，利用新型生物材料治疗肝组织损伤已成为新的研究方向和热点。 本课题利用猪小肠黏膜下层细胞外基质，经脱细胞处理制作温度敏感性水凝胶，并研究其对人肝细胞功能的影响及其对肝组织损伤修复发挥的作用。 小肠黏膜下层细胞外基质水凝胶的制备及其对肝组织损伤修复
