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1、实验十一 细菌常用生理生化反应实验接种,一 实验目的, 学习各种生理生化反应实验的原理 学习巩固各种生理生化反应实验的接种方式并熟练掌握各种接种方法,二 实验原理, 葡萄糖发酵实验原理： 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等）；产酸后溴甲酚紫指示剂可由紫色pH(6.8)变为黄色（pH5.2），产气的细菌可使半固体培养基中存有气泡 参见课本第109页, V. P. 反应和甲基红试验原理： V. P
2、. 反应：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧通过缩合和脱羧后转变成乙酰甲基甲醇（亦称三羟基丁酮），然后被还原为2，3丁二醇，乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被空气中的氧气氧化成为二乙酰，二乙酰再与蛋白胨中的精氨酸的胍基起作用生成红色化合物。此为VP正反应（若培养基中胍基太少，可加少量肌酸等胍基化合物）。在试管中加入-萘酚时，可促进反应进行。 甲基红反应：某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中的糖先分解为丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。有机酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色进行检测。甲基红变色范围为pH42（红）63（黄）。细菌分解葡萄糖产酸，将培养液由原来的橘黄色变为红
3、色，此为MR正反应。 参见课本第113页和114页。,吲哚实验原理：某些细菌能够分解培养基内蛋白胨中的色氨酸，产主吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合。形成玫瑰吲哚，为红色化合物，其反应如下：,参见课本第111页。, 硝酸盐还原实验原理：某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨和氮气等。如果细菌能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，当培养基中加入格利斯亚硝酸试剂时，则培养液呈粉红色或红色，为正反应。 如果在培养液中加入格利斯亚硝酸试剂后溶液不出现红色，则有两种可能性： 1）细菌不能还原硝酸盐，故培养后的培养液中仍有硝酸盐存在，此为负反应。2）硝酸盐被细菌还原为亚硝酸盐后，亚硝酸盐继续被还原成
4、氨和氮气，故培养液中也没有硝酸盐存在，此反应为正反应。培养液中硝酸盐存在与否可用下列方法检查：在培养液中加入二笨胺试剂，如溶液呈蓝色，则说明原来的硝酸盐未被还原，此系负反应。但如果在培养液中加入二苯胺试剂，溶液不呈现蓝色，则说明培养液中己不存在硝酸盐，故为正反应。,参见课本第119页。, 柠檬酸盐实验原理： 肠杆菌科各属细菌利用柠檬酸的能力不同，有的菌可利用柠檬酸钠作为碳源，有的则不能。某些菌分解柠檬酸形成CO2、由于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使培养基碱性增加，根据培养基中的指示剂变色情况来判断试验结果。指示剂可用1的溴麝香草酚蓝酒精溶液，变色范围为pH6.3（黄）76（蓝）,参见课本
5、第116页。, 明胶水解实验： 某些细菌能分泌明胶酶分解明胶，产生小分子物质。如果细菌具有分解明胶的能力，则平板培养基中的明胶被分解成小分子的物质，在平板上加上蛋白凝固剂后，明胶被分解部分的培养基呈现透明的状态，可以使菌落周围出现透明圈。,参见课本第108页。,7 淀粉水解实验原理,有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色 ,在平板上加上碘液后，有淀粉的部分培养基遇淀粉变为兰色, 淀粉被分解部分的培养基呈现透明的状态，可以使菌落周围出现透明圈。,参见课本第106页。,8 硫化氢产生实验原理,某些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化
6、氢，硫化氢遇重金属盐如铅盐、铁盐时则生成黑色硫化铅或硫化铁沉淀，从而可确定硫化氢的产生。在培养基中加入柠檬酸铁铵,培养后观察是否有黑色沉淀产生。培养基中加入硫代硫酸钠是为了保持低的氧化还原电位,防止产生的硫化氢被空气中的氧氧化,采用固体穿刺接种也是为了更好的保持低的氧化还原电位.,参见课本第117页。,三 实验器材,1 培养基：生理生化反应用的各种平板, 斜面,液体,半固体培养基. 2 器材：试管架，酒精灯，火柴，接种环(针)，牛皮纸, 记号笔等. 3 菌种: 大肠杆菌,产气杆菌, 变形杆菌,枯草杆菌,恶臭假单胞菌.,四 实验操作,(一) 接种: 标记按下表接种,(二) 培养 将接种好的培养基放在37培养箱中培养,两天后观察. 两天后(时间待定)观察.,五 思考题,1 微生物鉴定的基本步骤是什么? 2 常用于微生物分类鉴定的形态学特征有哪些? 3 常用于微生物分类鉴定的生理生化特征有哪些?,
