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1、巴斯德毕赤酵母表达系统,报告人：彭平平,起源及背景,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是8O年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。30年前Koichi Ogata首次发现有些酵母可以利用甲醇为唯一的碳源和能源.70年代Philips pertoleum公司就开发出高密度连续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。,80年代由Philips pertoleum公司合作开发毕赤酵母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。1993年Philips pertoleum公司委托Invrtig
2、one公司代理毕赤酵母表达系统的产品。,毕赤酵母与其它表达系统相比有许多优点1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达,4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为814个甘露糖基，更接
3、近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用6、使用方便、简单，而且成本较低,结构特点,一、单细胞微生物1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量的蛋白,二、微体（也称过氧化物酶体）1、 合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，亦不会对细胞产生毒害2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在AOX催化下产的H202对细胞的毒害。,醇氧化酶（AOX）甲醇 AOX 甲醛 H2O2微体 细胞,毕赤酵母质粒载体,几个概念,
4、同源基因重组 ：同源染色体的非姐妹染色单体的交叉互换引起的互换重组,穿梭质粒：是指人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。,pPIC9k质粒图谱,AOX-醇氧化酶 S - 分泌信号 MCS 多克隆位点 TT-终止信号 HIS4-组氨醇脱氢酶 Kanamycin-抗卡拉霉素基因 pBR322-大肠杆菌的复制起始位点 Ampicillin-抗氨苄青霉素基因,外源蛋白的引入表达,菌株类型,Mut表型与甲醇利用率,选择过程,HIS4缺陷培养基 G418酵母培养基低 高G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性 基因能对抗G418对酵母的毒性,
5、导入质粒,发酵过程,一般分为三个阶段：成长期，该阶段以甘油为碳源，主要目的是收获一定的菌量，该阶段一般采取分批补料的方式进行；过渡期，随成长期的结束酵母即进入过渡期，该期不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除对AOX1启动子阻遏；诱导期，即当甘油被消耗尽，过渡期结束时，在发酵液中流加甲醇诱导重组蛋白的表达。,应用举例 依森泰德（Exenatide）是首个合成肠促胰岛素类似物，具有多种降血糖作用。HAS：人血清白蛋白,Exenatide,Twice a day,2.4h被代谢,Exenatide,HSA,PCR 基因重组,Exenatide,HSA,Once a week,毕赤酵母表达外源蛋白示例,谢谢大家！,
