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1、专题5,DNA和蛋白质技术,课题1,DNA的粗提取和鉴定,讨论2：如何证明他们是遗传物质？,讨论3：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？,讨论1：构成生物体的遗传物质是什么？,1、提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2、生物大分子 主要指蛋白质、酶和核酸,3、提取DNA的基本思路 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分,基础知识,提取DNA的方法,4、DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，
2、或者相反,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,6、DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于
3、酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,7、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响 大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80C以上才会变性 洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,8、DNA的鉴定 DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 甲基绿 （蓝绿色）,（一）实验材料的选取,1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料） 2、原则：凡是含有
4、DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,实验设计,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞 动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,2、植物细胞 植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利
5、于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,（三）去除滤液中的杂质,为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低
6、盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离,（四） DNA的析出与鉴定,1、DNA的析出 DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ） ，静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,2、 DNA的鉴定 鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA
7、丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,操作提示,1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,二苯胺试剂的配制 称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液
8、中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。,1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）,500mL烧杯中，玻棒搅拌，离心、分离或静置沉淀。,2.提取DNA。,取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌。,纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。,.提取血细胞核物质：,.溶解核内的DNA：,滤液2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓搅拌。,三、实验步骤,.析出含DNA的粘稠物：,.滤取含DNA的粘稠物：,. DNA粘稠物的再溶解：,在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相
9、当于0.14mol/L）。,用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。,在20mL烧杯中轻缓搅拌3min，使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液。,.过滤含有DNA的NaCl溶液：,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤所得的溶液，滤液中含有DNA。,.提取含有杂质较少的DNA：,步骤所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。,3.DNA的鉴定：,加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。,1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”,2.加入“两次蒸馏水，三
10、次NaCl溶液，一次酒精”,三、实验小结,四、实验原理拓展介绍。,1.DNA的释放。,DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起，即释放的不是纯净的DNA，常称为DNA核蛋白。,2.DNA与蛋白质分离。,在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中,3.DNA的析出与获取。,因为DNA在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质的在其
11、中的溶解度大。所以在向含DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。,4.DNA的再溶解。,用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。,5.DNA的沉淀和浓缩。,对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液，必须再进一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法。即往含有Na的DNA溶液，加入体积分数为95%的冷却酒精，混匀后可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以用玻棒（玻棒有吸附DNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。,6.DNA的鉴定。,鉴定时蓝
12、色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出,使含DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的滤液中的杂质,提取DNA, A出现蓝色 B无变化,课题延伸,本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?,1.在
13、DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是( )。 A.稀释血液、冲洗样品 B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出 C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,答：B,答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液?,答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。,答：D,5.关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题： （1）鸡血细胞中红细胞含有细胞核，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中 细胞数目较多，可以提供丰富的 。 （2）实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是 。 （3）生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后， 结果是 ，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中无细胞核，若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为 。（4）若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加什么 程序，使组织细胞更易分离。,
