PCR技术及其应用

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1、任务四 PCR技术,项目一 基因工程及其在食品工业中的应用,PCR技术及其应用,聚合酶链式反应PCR技术（Polymerase Chain Reaction),一、PCR技术及发展历程 二、 PCR扩增原理 三、PCR操作程序 四、PCR的成分 五、PCR的条件 六、PCR引物设计原则 七、PCR技术的应用,本节主要内容,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个Eppendof管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至

2、百万倍。,（1）,1. PCR的发明,PCR发展简史,（2）,Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。,1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使Khorana的设想得到实现。其原理类似于DNA的体内复制 , Klenow酶催化，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。,1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。,当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。,（2）Taq DNA 聚合酶,1988年 R.K. Saiki 把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中。使PCR自动循环仪成为可能。,（3）PCR 仪,1988年 C

3、etus公司发明自动热循环仪。,1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年。,PCR仪,体内DNA的复制,DNA聚合酶（、）,SSB,解旋酶类,引物,复习,dNTP,Mg2+,原核细胞DNA的半不连续复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制的起始,DNA链的延长,DNA链终止,PCR技术的创建Kary B. Mullis（穆利斯1944）,Mullis的P

4、CR构思,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,10080604020,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术,72,94,55,PCR循环,1988年，Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR技术,聚合酶链式反应概念 （PCR：Polymerase Chain Reaction),聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ）又称PCR技术，是在体外酶促作用下扩增特异性DNA片段的技术。

5、,一对引物（primer）Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） DNA模板 （template） Mg2+ （magnesium）(一般将Mg2+加入缓冲液),PCR反应五要素,一、PCR技术及发展历程 二、 PCR扩增原理 三、PCR操作程序 四、PCR的成分 五、PCR的条件 六、PCR引物设计原则 七、PCR技术的应用,本节主要内容,DNA的变性和复性,加热、极端pH、有机试剂等可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双

6、链（其原有的特性和活性可以恢复）这称DNA复性, 也叫退火。,DNA双链解离一半的温度称为解链温度（ Tm值）。 Tm值范围常在8595，因此，PCR变性温度选择9095 ，时间1-2min,PCR技术的基本原理,根据体内细胞DNA半保留复制机理，在微量离心管中,加入适量的缓冲液(含MG2+), 模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热聚合酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸若干个循环后,DNA可扩增2n倍,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍.,PCR反应基本原理及反应步骤,变性 95,退火 Tm-5,延伸 72,反应步骤：

7、 高温变性 低温退火 中温延伸,双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAACTTG,ACGTACGTA,95oC,（1）DNA模板变性,模板,模板（template）,95oC,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的3端互补。,（2）DNA模板与引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC

8、,5,3,ACGTACGTA,5,3,引物,引物,引物（primer）:,40-65oC,DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。,（3）DNA链的延伸,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72oC,理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。,变性复性延伸。,1个循环的结果,新一轮循环开始,DNA elongation,PCR技术的基本原理,根据体内细胞DNA半保留复制机理，在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 模板DNA,四种脱氧单核苷酸

9、,耐热聚合酶, 一对合成的DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸若干个循环后,DNA可扩增2n倍,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍.,PCR反应曲线,目的DNA 的指数扩增并不是一个无限制的过程。通常经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，产物的量不再增加。“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能，模板DNA的拷贝数，底物dNTP浓度及多种因素。,一、PCR技术及发展历程 二、 PCR扩增原理 三、PCR操作程序 四、PCR的成分 五、PCR的条件 六、PCR引物设计原则 七、PCR技术的应用,本节主要内容,通常

10、进行PCR主要考虑反应体系 、反应参 数和DNA变性时间与终延伸时间三个方面内容,三、PCR操作程序,1、反应体系,2、反应参数,3、DNA变性时间与终延伸时间,4、PCR产物的分析,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,PCR反应体系的总体积依试验要求而定,反应参数PCR参数包括循环中三阶段的温度及持续时间控制，以及循环的次数，这在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与否 。通常PCR 反应所采取的反

11、应参数为：变性温度 95 60s退火温度 38-65 60s延伸温度 72 1-2s循环次数 30_35次复性温度决定与所用引物的长短与碱基组成，一般需要通过实验来确定。,DNA变性时间与终延伸时间为了使模板DNA双链充分打开 ，开始时模板DNA变性要适当延长，一般设预变性94 3_5min。一般在扩增完成后，PCR产物中可能含有长短不一的分子，都需要一步长时间的延伸反应，称为终延伸，时间要保持在10 min左右，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 反应终止后，可以放到4中保存，以备电泳检测。,经典循环参数（500bp以内）,95 变性60s 55 退火60s 72

12、延伸 1-2min,94 预变性 5min,30-35次,72 终延伸7min,4 Hold,4、PCR产物的分析,取5ulPCR产物,通过凝胶电泳可以大致判断产物纯度，或进行基因测序,一、PCR技术及发展历程 二、 PCR扩增原理 三、PCR操作程序 四、PCR的成分 五、PCR的条件 六、PCR引物设计原则 七、PCR技术的应用,本节主要内容,引物（primer）酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） 缓冲液,四、PCR反应的成分,（一）引物PCR中注意所用的引物浓度一

13、般20200pmol,这种浓度通常足以保证进行30轮以上的扩增。引物浓度偏高，会引起错配和非特异性产物的扩增，同时增加生成引物二聚体的几率。相反 ，如引物浓度不足，则聚合酶链式反应的效率极低,引物是与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（ 5端相同）的短DNA。,3,3,（二）DNA聚合酶耐高温的Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断，PCR技术才进入实用阶段。,Taq DNA聚合酶特点, 热稳定性,最适温度：75oC ，延伸温度选择72,Taq酶的功能缺点,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！,TaqDNA聚合酶对M

14、g2+ 敏感,dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。,（三）三磷酸脱氧核苷酸dNTPs,浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。,一般商品化供应的dNTP溶液pH为7.0，各dNTP的 浓度为2.5mmol/L,一般使用浓度控制在20-200umol/L。四种各dNTP分子浓度必须相等，以减少错配。,（四）Mg 2+ 的浓度,Mg2+浓度太高会增加非特异产物（杂带）。,镁离子浓度对PCR反应影响很大，既影响到Taq DNA聚合酶的活性和真实性，又影响到引物退火、模板和PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体生成等。PCR体系中的酶离子浓度在0.52

15、.5mol/L。,（五）模板PCR的模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环状分子，不过线状分子比环状分子的扩增效果稍好。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。,PCR对模板DNA的纯度要求不高。,但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。,模板的量不能太多，100l反应体系中100ng足够。过多引起非特异性产物。,一、PCR技术及发展历程 二、 PCR扩增原理 三、PCR操作程序 四、PCR的成分 五、PCR的条件 六、PCR引物设计原则 七、PCR技术的应用,本节主要内容,五、PCR的条件 （一）变性的时间和温度模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的重要原因。一般在第一轮循环前先进行94预变性310min，以便使模板DNA完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶趁热启动，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性而引起的非特异性扩增。,