NK杀伤实验

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1、实验一 肿瘤细胞增殖抑制实验,（细胞活力分析仪）,原 理,Vi-CELL XR活力分析仪是视频成像系统，用于分析培养基或悬浮液中的酵母、昆虫和哺乳动物细胞。该分析仪可自动执行目前已被广泛接受的台盼蓝染色排除法，适用于多种细胞类型的分析。当细胞死亡，细胞膜破裂，从而使台盼蓝染料能够透过。结果，死细胞或已失去活力的细胞颜色比活细胞要深一些。通过对这种色调的对比测量，从而能够测量到细胞活力。,台盼蓝染色排除法示意图,活细胞排除染料,染料透过死细胞,图像分析方案,贝克曼库尔特Vi-CELL XR系统可自动执行台盼蓝染色法。通过最新的视频捕获技术和样品处理法，Vi-CELL XR将抽取细胞样品转移到流动

2、池，然后照相机对其进行拍照。Vi-CELL XR至少可拍摄100张图像，以用于细胞活力检测。对细胞是否已吸收台盼蓝染料，可通过软件进行确定。吸收了台盼蓝染料的细胞，颜色要深一些，因此其灰度值较低。而具有高灰度值的细胞可视为活细胞。,与MTT法之间的比较,Vi-CELL细胞活力计数可对一个或多个实验组的总细胞数和死细胞数进行绝对计数，而MTT则通过测定活细胞所形成的甲臜溶解后的光密度值间接反映活细胞数量，二者的原理不同。 由MTT还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被DMSO溶解后才能检测, 会对实验结果的准确性产生一定影响；而且MTT从加入到进行检测需要4个小时，方法烦琐，耗时较长。Vi-CELL

3、细胞活力计数法可即时检测，相对简单。 在进行贴壁细胞的检测时，MTT法可直接加入MTT，进行检测；而采用细胞活力计数法则必须将培养板中的细胞消化下来，再进行计数。,Vi-cell操作步骤,一、登陆样品 将至少为0.5mL（最多为2.0mL）的样品放入样品杯内。1. 将样品杯置于下一个可用的样品架位置。2. 单击Log in sample（登录样品）按钮，以登录样品。 在样品架上选择样品杯位置（适用时）。 输入Sample ID（样品ID）。注意不要使用特殊字符如 、= 、: 、 /等。 选择Cell type（细胞类型）。 如果样品已预先经过稀释，选择Dilution factor（稀释因子）

4、。 单击OK（确定）。,按下Start queue（开始排列），即可开始进行分析。,二、选择细胞类型在登录样品后，选择适当的细胞类型。如果细胞类型不存在，新建一个细胞类型。细胞类型可以通过单击导航栏上的细胞类型图标进行查看。 细胞类型图标,细胞类型屏幕操作人员应对每种细胞类型预先设置仪器和测量参数，以确保分析结果准确。,三、记录数据,如图所示：活细胞为白色，周围有绿色线包围，死细胞为黑色，周围有红线包围。,注意事项：,1. 细胞活力以百分比、浓度和细胞数表示。 2. 浓度检测范围在50,000-10,000,000个细胞/毫升。 3. 细胞直径在3-70m。容许的最小直径为3m。利用最 小直径

5、可排除碎片和/或不需要的细胞。细胞类型容许的 最大直径为70m。 4. 样品杯中样品至少0.5ml，最多2ml。 5. 试剂盒类型：绿色 - 缓冲液；红色 - 消毒剂；黄色 - 洗涤 剂；蓝色 - 台盼蓝试剂 6. 注意试剂盒试剂含量，更换备用试剂盒。 7. 处理废液注意安全,肿瘤细胞增殖抑制实验 （MTT法）,原 理,四甲基偶氮唑盐 (MTT) 是一种黄色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，将淡黄色的MTT还原成蓝紫色、不溶于水的甲臜（Formazan）颗粒。该颗粒溶解后，其液体的吸光度值（A）与活细胞数及细胞代谢活性呈正相关。因此可根据光密度A

6、值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会产生甲臜。,实验方法:,取对数生长期的U937细胞，台盼蓝染色检测细胞活性。 调细胞浓度为 5104/ml, 接种于96孔板, 每孔100l, 将不同浓度药物经倍比稀释后分别加入各孔中，分别设200ug/ml,100ug/ml,50ug/ml三组, 每种浓度3个复孔，另设细胞对照组。对照组：100l细胞 100l 培养液各实验组：100l细胞 100l抗肿瘤药物溶液 将培养板置于37, 5% CO2孵箱孵育48h.,5. 培养结束前4小时加入MTT（5mg/ml），10ul/孔。 6. 酶标仪检测各组A值，570nm为检测

7、波长，630nm为参考波长。 7计算不同浓度药物对U937细胞的增殖抑制率。抑制百分率 = ( 对照组A570-630实验组A570-630) / 对照组A570-630 100%。 8绘制增殖抑制曲线。,注意事项,1. 严格无菌操作，避免污染。细胞计数、加板要准确。 2. 采用不同浓度药物溶液进行实验时，必须进行倍比稀释，使加样时每孔细胞溶液和药物溶液均为100ul。切勿使用移液器将未经稀释的药物原液直接加入96孔板内。,实验二 NK细胞杀伤功能测定,（MTT法）,淋巴细胞分离技术 分离液密度梯度离心分离法,原 理淋巴细胞分离液是由聚蔗糖（Ficoll）和泛影葡胺（Hypzue）按一定比例混

8、合制成，其分子量大又无化学活性，20C时比重为1.077+0.002，淋巴细胞比重为1.070与之相似，而粒细胞和红细胞比重为1.092左右。分离时，血液或其他细胞液层加于分离液上，形成清楚界面，通过离心，使一定比例的细胞按一定密度梯度分布：粒细胞和红细胞沉于分离液以下，淋巴细胞在清楚界面上形成纯细胞层，从而把淋巴细胞分离出来。,Ficoll-Hypaque-,Diluted blood-,-Plasma,-Lymphocyte,Monocyte,-Ficoll-Hypaque,Centrifugation,Ficoll-Hypaque density gradient centrifugat

9、ion,材料仪器1、肝素防凝人外周血（肝素500U/ml） 2、淋巴细胞分离液、无Ca2+、Mg2+Hanks液（Hanks液）、10%小牛血清RPMI1640培养液（1640培液）、 白细胞稀释液、苔盼蓝染液 3、可调式移液器、吸头、离心管、平口滴管、吸管、细胞计数板等 4、生物安全柜（无菌操作时采用）、普通显微镜等,方 法 1 肝素防凝人外周血加入1 - 4倍量Hanks液稀释混匀。 2、 取2ml淋巴细胞分离液加入10ml离心管中，将稀释的血 液用滴管沿离心管壁层加于分离液上（血：分离液=1- 4：1），保持两者的清楚界面。 3、 水平离心2000rpm/15分，小心取出。 4、 用平口

10、滴管小心吸出界面上白色雾状的淋巴细胞层，用 Hanks液洗二次，离心分别为第一次2000 rpm/10分； 第二次1500 rpm/10分。 5、 加1640培液0.5-1ml悬起、混匀细胞。,6、 细胞活力测定：取少许混匀细胞加入苔盼蓝染液（细 胞:染液=1:1），低倍镜下观察，不着色者为活细胞， 着色者为死细胞。计数200个细胞，计算活细胞百分率。 7、 细胞计数：混匀细胞，用白细胞稀释液做一定稀释后，灌 于细胞计数板的计算池内，低倍镜下计数，按下式计算每 ml细胞数：细胞数/ml = 4个大方格细胞数4稀释倍数104 8、 用1640培液将细胞调至所需浓度备用。,注意事项1、分离细胞时严

11、格保持血液/细胞悬液与分离液两 者的清楚界面，切勿形成气泡。 2、细胞活力测定时，活细胞应达95%以上。,实验原理,四甲基偶氮唑盐 (MTT) 是一种黄色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，将淡黄色的MTT还原成蓝紫色、不溶于水的甲臜（Formazan）颗粒。该颗粒溶解后，其液体的吸光度值（A）与活细胞数及细胞代谢活性呈正相关。因此可根据光密度A值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会产生甲臜。,材料仪器,1、肝素防凝外周血（肝素500U/ml）、NK靶细胞：K562细 胞（人红白血病细胞株） 2、淋巴细胞分离液、无

12、Ca2+、Mg2+Hanks液（Hanks 液）、5mg/ml MTT、RPMI1640培养液、白细胞稀释 液、苔盼蓝染液、生理盐水 3、 96孔圆底、平底培养板、可调式移液器、吸头、离心 管、滴管、吸管、细胞计数板等 4、 生物安全柜、CO2培养箱、酶标仪、普通显微镜、倒置 显微镜等,方 法,1、 K562细胞传代培养，取生长旺盛的细胞备用。 2、 肝素防凝外周血常规分离淋巴细胞（见附：淋巴细胞分离 技术），Hanks液洗三次，计数及活力测定后，用1640培 液调细胞数为5、2.5106 /ml。 3、 取预先培养好、生长旺盛的K562细胞，Hanks液 1500rpm/10分洗三次，生理盐

13、水稀释计数及活力测定后， 用1640培液调细胞数为1105 /ml。 4、将效靶比=50:1、25:1的淋巴细胞（效）、 K562细胞（靶） 加入96孔圆底板：实验组分别加入各效靶比的效、靶细胞 各100l/孔；同时设靶细胞孔及效应细胞孔作为对照孔。 上述各组均设3个复孔。另加仪器调零孔1640培液200l/ 孔，1孔。,靶细胞 每孔靶细胞（1104）和1640培液各100l 效应细胞 50: 1 每孔效应细胞（5105）和1640培液各100l50: 1 效应细胞(5105), 靶细胞（1104）各100l 效应细胞 25: 1 每孔效应细胞（2.5105）和1640培液各100l25: 1

14、 效应细胞(2.5105), 靶细胞（1104）各100l离心500rpm/5min，使效靶细胞密切结合。,5、置37、5% CO2培养箱培养4小时。 6、每孔加入10l MTT (5 mg/ml)，继续孵育4小时。 7、3000rpm/10min，离心，弃上清，每孔加DMSO 150 l，充分混匀，10分钟内酶标仪检测570 nm波长A值。按下述公式计算杀伤率:杀伤率( %)=1(实验孔A值效应细胞孔A值) / 靶细胞孔A值100%,结果判定,1、实验孔的A值应高于效应细胞和靶细胞对 照孔。 2、人外周血NK细胞杀伤活性正常参考值： 效靶比=50:1，男性48.65 + 17.29%；女 性

15、50.10 + 15.33%注意事项效靶细胞的计数及加样要准确。,实验三 酶联免疫吸附实验,（ELISA）,ELISA是酶联免疫吸附实验( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。,（一）基本原理,1、 基本原理先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化

16、显色，进行抗原或抗体的定性或定量检测。,2、常用方法 （1）间接法 此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测定（图1）。,图1 间接法测抗体示意图,（2）双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和底物显色进行测定（图2）。,图2 双抗体夹心法测抗原示意图,（3）竞争法 此法常用于测抗原和半抗原，也用于测抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原，使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。,