生化工艺第三章 培养基制备

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1、培养基制备,第三章,培养基制备,第一节 工业发酵培养基 第二节 培养基的类型及选择 第三节 培养基配制 第四节 淀粉水解糖的制备 第五节 生化发酵原料,第一节 工业发酵培养基,一、工业常用的碳源碳源是组成培养基的主要成分之一。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。在特殊情况下，蛋白质水解产物或氨基酸等也可被某些菌种作为碳源使用,由于菌种所含的酶系统不完全一样，各自菌种对不同碳源的利用速率和效率也不一样，如表3-1列出了某些细菌在不同碳源上生物是的得率，从表中可见同样消耗1克基质，不同碳源得到的菌体相差很多。,第一节 工业发酵培养基,表3-1 细胞在不同碳源中的细胞得率,第一节 工业发酵培养基

2、,葡萄糖是碳源中最易利用的糖，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。但是过多的葡萄糖会过份加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中音代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。,第一节 工业发酵培养基,糖蜜是制糖时的结晶母液，它是蔗糖厂的副产物。糖蜜含有较丰富的糖、氮素化合物和无机盐维生素等，它是微生物工业的价廉物美的原料。这种糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达5075%，一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，二者在糖的含量和无机盐的含量

3、都有所不同，使用时应注意。糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生产中，抗生素等微生物工业也常用它作碳源。在酒精生产中若用糖蜜代甘薯粉，则可省去蒸煮、制曲、糖化等过程，简化了酒精的生产工艺。,第一节 工业发酵培养基,淀粉、糊精等多糖也是常用的碳源，它们一般都要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。淀粉在发酵工业中被普遍使用，因为它利用可克服葡萄糖代谢过快的弊病，同时淀粉来源丰富，价格也比较低廉。常用的淀粉为玉米淀粉，小麦淀粉和甘薯淀粉等。对有些微生物还可直接利用玉米粉、甘薯粉、土豆粉作碳源。 麦芽被广泛使用在啤酒工业中。纤维素和一些野生的含淀粉较多的植物也是今后开发碳源的广阔天地。它们的成分见表3-

4、2。,第一节 工业发酵培养基,表3-2 一些野生植物的化学成分,第一节 工业发酵培养基,油和脂肪也能被许多微生物用作碳源和能源。这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶。在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解成甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO2和水，并释放出大量的能量。因此，当微生物利用脂肪作碳源时， 要供给比糖代谢更多的氧，不然大量脂肪酸和代谢中的有机酸积累，会引起培养液pH下降，并影响微生物酶系统的作用。常用的油有豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉子油等。,第一节 工业发酵培养基,一些微生物对许多有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙酸等）有很强的氧化能力。因此有机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源

5、。有机酸的利用常会使pH上升，尤其是有机酸盐氧化时常伴随着碱性物质的产生，使pH进一步上升。不同的碳源在其分氧化时，对pH的影响各不相同。因此不同的碳源和浓度不公对微生物碳代谢有影响，而且对整个发酵过程中pH的调节和控制也均有影响。,第一节 工业发酵培养基,二、工业常用的氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1. 有机氮源 常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒槽等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢。

6、,第一节 工业发酵培养基,有机氮源除含有丰富的蛋白质，多肽和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，因而微生物在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌丝浓度增长迅速的特点，这可能是微生物在有机氮源培养基中，直接利用氨基酸和其它有机氮化合物中的各种不同结构的碳架，来合成生命所需要的蛋白质和其它细胞物质，而无需从糖代谢的分解产物来合成种种所需的物质。有些微生物对氨基酸有特殊的需要。,第一节 工业发酵培养基,有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是产物的前体。例如缬氨酸、半胶氨酸和-氮基已二酸是合成青霉素和头孢菌素的主要前体，甘氨酸可作为L-丝氨酸的前体等。2

7、.无机氮源常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快，所以也称之为迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4 2NH3+H2SO4NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH,第一节 工业发酵培养基,反应中所产生的NH3被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质。若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠；正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。例如在制液体曲时，用NaNO3的代谢而得到的NaOH可

8、中和生长所释放出的酸，使pH稳定在工艺要求的范围内，又如在另一株黑曲霉发酵过程中用(NH4)2SO4作氮源培养液中留下的SO42-使pH下降，而这对提高糖化型淀粉酶的活力有利。且较低的pH还能抑制杂菌的生长，防止污染。,第一节 工业发酵培养基,氨水在发酵中除可以调节pH外，它也是一种容易被利用的氮源，在许多抗生素的生产中得到普遍的使用，以链霉素为例，从其生物合成的代谢途径中可知：合成1mol的链霉需要消耗7mol的NH3。红霉素生产中也有用通氨的，它可以提高红霉素的产率和有效组分的比例。氨水因碱性较强，因此使用时要防止局部过碱，加强搅拌，并少量多次的加入。另外在氨水中还含有多种嗜碱性微生物，因

9、此在使用前应用碱石棉等过滤介质进行除菌过滤。这样可防止因通氨而引起的污染。,第一节 工业发酵培养基,三 、 无机盐及微量元素微生物在生长素和生产过程中，需要某些无机盐和微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、铁、氯、锰、锌、钴等，以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。这些物质一般在低浓度进对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。而各种不同微生物及同种微生物在不同的生长阶段对这些物质的最适浓度要求均不相同，因此，在生产中要通过试验预先了解菌种对无机盐和微量元素的最适需求量，以稳定或提高产量。,第一节 工业发酵培养基,在培养基中，镁、磷、钾、硫、钙和氯等常以盐的形式（

10、如硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钙、氯化钾等）加入，而钴、铜、铁、锰、锌、钼等缺少了对微生物生长固然不利，但因其需要量很少，除了合成培养基外，一般在复合培养基中不再另外单独加入。因为复合培养基中的许多动、植物原料如花生饼粉、黄豆饼粉、蛋白胨等都含有微量元素。但有些发酵工业中也有单独加入微量元素的，例如生产维生素B12，尽管用的也是天然复合材料，但因钴是维生素B12的组成成分，因此其需要量是随产物量的增加而增加，所以在培养基中就需要加入氯化钴以补充钴。,第一节 工业发酵培养基,磷 是核酸和蛋白质的必要成分，也是重要的能量传递者-三磷酸腺苷的成分；在代谢途径的调节方面，磷起着很重要的作用，磷

11、有利于糖代谢的进行，因此它能促进微生物的生长，但磷若过量时，许多产物的合成常受到抑制，例如在谷氨酸的合成中，磷浓度过高就会抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，使菌体生长旺盛，而谷氨酸的产量却很低，代谢向缬氨酸方向转化。还有许多产品如链霉素、土霉素、新生霉素、柠檬酸（表面培养）等都受到磷浓度的影响。,第一节 工业发酵培养基,据文献报导，许多次级代谢过程对磷酸盐浓度的承受限度比生长繁殖过程低，所以必须严格控制。但有一些产物要求磷酸盐浓度的高些。如黑曲霉NRRL330菌种生产-淀粉酶，若加入0.2%磷酸二氢钾则活力可比低磷酸盐提高3倍。还有报导用地衣芽孢杆菌生产-淀粉酶时，添加超过菌体生长所需要的磷酸盐

12、浓度，则能显著增加-淀粉酶的产量。钙 培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀，降低了培养基中可溶性磷的含量，因此，当培养基中磷和钙均要求较高浓度时，可将二者分别消毒或逐步补加。,第一节 工业发酵培养基,镁 除了组成某些细胞的叶绿素的成分外，并不参与任何细胞物质的组成。但它处于离子状态时，则是许多重要酶（如已糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶，羧化酶等）的激活剂，镁离子不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成。镁离子对一些氨基糖苷类抗生素的产生菌有提高菌体对自身所产的抗生素的耐受能力的作用，如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。镁常以硫酸镁的形式加入培养基中，便在碱性溶液中会生成氢氧化镁沉淀，因此配料时要注意

13、。,第一节 工业发酵培养基,硫 存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基，如辅酶A，硫锌酸和谷胱甘肽等。在某些产物（如青霉素、头孢霉素等）分子中硫是其组成部分。所以在这些产物的生产培养基中，需要加入如硫酸钠或硫代硫酸钠等含硫化合物作硫源。 铁 它是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。工业生产上一般用铁制发酵罐，这种发酵罐内的溶液即使不加任何含铁化合物，其铁离子浓度已达到30g/mL另外一些天然培养基的原料中也含有铁，所以在一般发酵培养基中不再加入含铁化合物。,第一节 工业发酵培养基,而有些产品对铁很敏感，如青霉素要求最适铁含量在

14、20g/mL以下。又如在柠檬酸生产中，铁离子的存在会激活顺乌头酸酶的活力，使柠檬酸进一下代谢为异柠檬酸，这样不但降低了产率，而且还给提取工段带来麻烦，据报导在无铁培养基中产酸率可比含铁培养基提高近3倍。生产啤酒时，糖化用水若铁离子浓度高，就会降低酵母的发酵活力，引起啤酒的冷混浊，影响啤酒质量。一般酿造用水铁离子含量应在0.20.5mg/L以下。因此上述产品应使用不锈钢发酵罐。新发酵罐往往会造成培养基铁离子浓度过高，所以要加以处理。处理方法采用在罐内壁涂生漆或耐热环氧树脂等作保护剂防止铁离子脱落。,第一节 工业发酵培养基,氯 氯离子在一般微生物中不具有营养作用，胆对一些嗜盐菌来讲是需要的。在一些

15、产生含氯代谢物（如金霉素和灰黄霉素等）的发酵中，除了从其它天然原料和水中带入的氯离子外，还需加入约0.1%氯化钾以补充氯离子。啤酒在糖化时，氯离子含量在2060mg/L范围内，则能赋予啤酒口味柔和，并对酵和酵母的活性有一定的促进作用。但氯离子含量过高会引起酵母早衰，使啤酒带有咸味。,第一节 工业发酵培养基,钠、钾、钙 钠、钾、钙等离子虽不参与细胞的组成，但仍是微生物发酵培养基的必要成分。钠离子与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加入少量钠盐，只用量不能过高。否则会影响微生物的生长。钾离子也与细胞渗透压和透性有关，并且还是许多酶的激活剂，它能促进糖代谢。在谷氨酸发酵中，菌体生长时需要钾离子约0.

16、01%，生产谷氨酸时需要量约为0.02%0.1%(以K2SO4计)。钙离子能控制细胞透性，它不能逆转高浓度无机磷对某些产品如链霉素等的抑制作用。,第一节 工业发酵培养基,常用的碳酸钙本身不溶于水，几乎是中性，但它能与代谢过程中的pH有一定的调节作用。在配制培养基时要注意，先要将配好的培养基用碱调到到PH近中性，才能将CaCO3加入培养基中,这样可以防止CaCO3在酸性培养基中被分解,而失去其在发酵过程中的缓冲能力,所采用的要CaCO3要对其中CaO等杂质含量作严格控制.锌、钴、锰、铜 锌、钴、锰、铜等微量元素大部分作为酶的辅基和激活剂，一般来讲只有在合成培养基中才需加入这些元素。,第一节 工业发酵培养基,四、前体物质和促进剂发酵培养基中某些成分的加入有助于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些添加的物质包括前体、抑制剂和促进剂（包括诱导剂、生长因子等）。1前体物质指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大的变化，但是产物的产量却因加入前体面有较大的提高。前体最早是从青霉素的生产中发现的。,