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1、维生素的作用 维生素是维持人体正常生理功能必需的一类天然有机化合物，其主要功用是通过作为辅酶的成分调节代谢。维生素一般在体内不能合成或合成数量较少，不能充分满足机体需要，必须经常由食物来供给。 维生素的种类 维生素的种类很多，可分为脂溶性维生素和水溶性维生素。脂溶性维生素有A、D、E、K等，水溶性维生素有维生素C和B。在这些维生素中，人体比较容易缺乏而在营养上又较重要的维生素有：A、D、 C 、 E、B1、B2、B6、 烟酸。 维生素的检验方法 检验方法 中有紫外可见分光光度法、荧光光度法， 这两种是多种维生素的标准分析方法。灵敏、快速，有较好的选择性。另外，各种色谱法以其高分离效能，在维生素
2、分析方面占有重要的地位。,1、维生素A的测定三氯化锑光度法维生素A的测定方法除三氯化锑光度法外，还有紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法和高效液相色谱法等。 （1）原理 在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑可相互作用，生成蓝色可溶性配合物，其颜色深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质在一定时间内可用分光光度计测定其吸光度（于620nm波长处有最大吸收峰），其吸光度与维生素A的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。,一、脂溶性维生素的测定,（2）试剂 无水硫酸钠 不吸附维生素A 乙酸酐 无水乙醚 不含过氧化物 无水乙醇 不含醛类物质 三氯甲烷 不含分解物 250gL三氯化锑一三氯甲烷溶液
3、1：1氢氧化钾溶液 （50%） 0.5molL氢氧化钾溶液 维生素A标准溶液 酚酞指示剂,（4）操作步骤 样品处理 根据样品性质，可采用皂化法或研磨法 标准曲线的绘制 准确取一定量的维生素标准液于个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取mL三氯甲烷和标准系列使用液mL，各管加入乙酸酐1滴制成标准比色系列。于620nm波长外，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入mL三氯化锑三氯甲烷溶液。于s内测定吸光度，绘出标准曲线图。,（3）仪器和设备 分光光度计 回流冷凝装置,皂化法:适用于维生素A含量不高的样品(可减少脂溶性物质的干扰,但费时,维生素A
4、易损失) 1、皂化：称取0.55克样品于三角瓶中，加入10mL氢氧化钾及2040mL乙醇，于电热板上回流30min至皂化完全为止。 2、提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗中。皂化瓶再用约30mL乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。, 样品测定于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入mL 样品溶液及1滴乙酸酐。以下步骤同标准曲线的制备。,3、洗涤
5、：用约30mL水加入第一个分液漏斗中，轻摇，静置片刻，放去水层，加1520mL0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中，轻摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。再用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止。醚层液静置1020min，小心放出析出的水。 4、浓缩：将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠2次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，收回乙醚。直到瓶中剩5mL时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。,研磨法：适用于每克样品维生素A含量大于510g样品的测定（步骤简单，结果准确） 1、研磨：精确
6、称取25g样品，放入盛有35倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。 2、提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50100mL乙醚，紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中，使其自行澄清（或离心澄清）。 3、浓缩：取澄清乙醚液25mL，放入比色管中，在7080水浴上抽气蒸干，立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。,（5）结果计算 X-样品中维生素的含量，mg/100g（若按国际单位，每国际单位相当于.3g维生素）； c-由标准曲线上查得样品中含维生素的含量，gmL； m-样品质量，g ； -提取后加三氯甲烷定量之体积，mL ； 100-以每
7、100g 样品计。,（一）维生素C的测定维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。 方法：测定维生素C常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法和高效液相色谱法等。以下介绍荧光法、2，4-二硝基苯肼光度法。 1、荧光法 （1）原理：试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。,二、水溶性维生素的测定,（2）试剂： 偏磷酸冰醋酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水
8、稀释至500mL过滤后，贮存于冰箱中； 硫酸：0.15mol/L 偏磷酸乙酸硫酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用0.015molL-1硫酸稀释至500mL； 乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠溶解并稀释至1L； 硼酸乙酸钠溶液：称取硼酸9g，加入35mL乙酸钠溶液，用水稀释至1000mL； 邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺盐酸盐溶于100mL水中； 抗坏血酸标准溶液：准确称取0.500g抗坏血酸溶于偏磷酸冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，吸取上述溶液5mL，再用偏磷酸冰醋酸溶液定容至50mL；,抗坏血酸标准使用溶液：100g/mL 百里酚蓝指示剂(麝香草酚蓝)：变色范围pH1
9、.2(红)2.8(黄)； 活性炭：取50g活性炭加入250mL10%盐酸，加热至沸，减压过滤，用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液中无铁离子为止，于110120烘干。 （3）仪器：荧光分光光度计或具有350nm及430nm 波长的荧光计；捣碎机。 （4）操作步骤： 试样的制备：称取100克鲜样,加100mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入捣碎机内打成匀浆，先取少量样品加入1滴百里酚蓝，若显红色(pH=1.2)，即用偏磷酸冰醋酸溶液定容至100mL；若显黄色(pH=2.8)，即用偏磷酸冰醋酸硫酸溶液定容至100mL，定容后过滤备用。,测定： 氧化处理：将上述滤液及抗坏血酸标准使用液各100ml转入三角瓶中加入12
10、g活性炭振摇12分钟，过滤。即试样氧化液和标准氧化液，待测定。 各取10mL标准氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白” 各取10mL试样氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明“试样”及“试样空白” 于“标准空白”及“试样空白”中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至100mL，在4冰箱中放置23小时，即得“标准空白”溶液及“试样空白”溶液，备用。 于“试样”及“标准”中各加5mL /L乙酸钠溶液，用水稀释至100mL,即得“试样”溶液及“标准”溶液，备用。,标准曲线的制备：取上述“标准”溶液（抗坏血酸含量10g/mL）0.5、1.0、1.5和2.0
11、mL标准系列，取双份分别置于10mL带盖试管中，再用水补充至2.0mL。取中“标准空白”溶液，“样品空白”溶液及中“样品”溶液各2mL，分别置于10mL带盖试管中。在暗室迅速向各客中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发光波长338nm、发射光波长420nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。,（5）结果计算：式中 X-试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；c-由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度， g/mLm-试样的质量，g；V-荧光
12、反应所用试样体积，mL；F-试样溶液的稀释倍数。,（1）测定原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4 二硝基苯肼作用生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。,2、 2，4-二硝基苯肼光度法,（2）试剂 本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。 4.5mol/L硫酸：谨慎地加250mL硫酸（比重1.84）于700mL水中，冷却后用水稀释至1000mL。 85%硫酸：谨慎地加90mL硫酸（比重1.84）于100mL水中。 2，4 二硝基苯肼溶液2%：溶解2g 2，4 二硝基苯肼于100mL 4.5
13、mol/L硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。 草酸溶液2% ：溶解20g草酸（H2C2O4）于700mL水中，稀释至1000mL。 草酸溶液1% ：稀释500mL 2%草酸溶液到1000mL。 硫脲溶液1% ：溶解5g硫脲于500mL 1%草酸溶液中。 硫脲溶液2% ：溶解10g硫脲于500mL 1%草酸溶液中。 盐酸1mol/L ：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。 抗坏血酸标准溶液：溶解100mg纯抗坏血酸于100mL 1%草酸中，配成每毫升相当于1mg抗坏血酸。 活性炭：将100g活性炭加到750mL1mol/L盐酸中，回流12h，过滤，用水洗数次，至滤液
14、中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110烘箱中烘干。,检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。 （3）仪器和设备 恒温箱：370.5 ；可见 紫外分光光度计；捣碎机。,（4）操作步骤 样品的制备： a、鲜样的制备：称100g鲜样和100g 2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取1040g匀浆（含12mg抗坏血酸）倒入100mL容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 b、干样制备：称14g干样（含12mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 将上述
15、滤液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。 氧化处理：取25mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1 min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入10mL2%硫脲溶液，混匀。,呈色反应：于三个试管中各加入4mL经氧化的试样稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0mL2%2，4 二硝基苯肼溶液，将所有试管放入370.5恒温箱或水浴中，保温3h。 3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中，空白管取出后使其冷到室温。然后加入1.0mL2%2，4 二硝基苯肼溶液，在室温中放置1015min后放入冰水内。其余步骤同样品。 85%硫酸处理：当试管
16、放入冰水后，向每一试管中加入5mL85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。 比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。, 标准曲线绘制： a、加2g活性炭于50mL标准溶液中，摇动1 min，过滤。 b、取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度20g/mL。 c、取5mL，10mL，20mL，25mL，40mL，50mL，60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12g/mL。 d、按样品测定步骤形成脎并比色。 e、以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（g/mL）为横坐标绘制标准曲线。,
