信阳市疟原虫镜检技术

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1、疟原虫的镜检技术,信阳市疾病预防控制中心,寄生虫病防治科,疟疾的实验室诊断,1.病原学诊断：显微镜血涂片查见疟原虫，这种 镜检确诊最可靠。 2.免疫学诊断：（1）循环抗原的检测 （2）循环抗体的检测 3.分子生物学技术：PCR和DNA探针已应用于疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微镜检查。,疟原虫的镜检技术,1. 血膜制作与染色。 2. 厚、薄血膜中间日疟、恶性疟各期疟原虫的形态结构及其鉴别要点。 3. 镜检示教。,血膜的制作（所需设备）,1.载玻片：新玻片浸入有液态洗涤剂的清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用

2、干净柔软的棉巾将玻片擦亮。已用过的玻片浸泡于洗涤剂溶液中1-2天，或浸泡于煮沸的5%肥皂水中1-2小时，再放入新配置的洗涤剂溶液中1-2小时，逐个擦去血膜痕迹，清水漂洗干净，擦亮。 2. 采血针：一次性 3.玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜 4.75%酒精棉球：采血前后消毒 5.记号笔（2B铅笔）：玻片上书写号码,血膜的制作（取血时间）,采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机，但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。 间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性；发冷（寒战）

3、期相当于红内期成熟裂殖体胀破红细胞期，镜检多见裂殖体和环状体；发热期外周血中以环状体（小滋养体）为主；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性；发作后数小时（h），间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机。发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后20h内取血，初发患者退热后常查不到原虫。,取血部位和方法,耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅（12mm为宜）。然后用左手大拇指、食指和右手中指协同轻轻挤压出血

4、滴。,血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。,薄血膜涂片操作,薄血膜 取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘的中点刮取血液1.01.5微升（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中线接触，待血液向两侧扩展约2cm宽时，以2535夹角均匀而迅速地向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。也可载玻片平置在桌面上操作厚度以薄血膜上的红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。,正确的推片姿势,厚血膜涂片操作,用推片的一角刮取45微升血量（相当于火柴头大小），使血滴涂于载玻片的

5、中央偏右处，由里向外一个方向旋转24圈，涂成直径0.81.0cm的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油镜视野内可见510个白细胞为宜）。,血膜的制作（血膜的位置）,通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。,标准的疟疾厚薄血膜片位置,血膜的制作（编号）,血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用2B铅笔于薄血膜中写上受检者的个人编号，依次按顺序插入标本盒内。,制作血膜注意事项,1.清洗玻片，且勿碰撞、磨损 载玻片必须完

6、全清洁无油渍或污垢。制片时，手指勿接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内 厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘，防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时装入标本盒并盖严。 3.血膜应自然干燥 切忌在毒太阳下晒或火烤，加快其干燥可采用手上或衣服摩擦、风吹，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24-48h内固定染色；冬天也不能超过72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血

7、膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干后装入盒内盖严，待以后染色。,染液的种类,染液种类：目前临床上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain）和吉氏染液（Giemsa stain）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。我们主要用吉氏染液，它具有方便、染色效果稳定、便于长期保存的优点。瑞氏染液染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室使用。,染液的染色原理,红细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷的-NH3+和一个带负电荷的-COO-。碱性染料美蓝的有色基团带阳离子，可与细胞中带负电

8、荷的-COO-部分结合，使之成为蓝色。疟原虫、淋巴细胞和大单核细胞的胞浆、嗜碱性粒细胞的颗粒等酸性蛋白质，被染成蓝色。酸性染料伊红的有色基团带阴离子，可与细胞中带正电荷的-NH3+部分结合，使之呈红色；美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着色，但美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，在媒染物与染料的共同作用下，疟原虫和白细胞核被染成紫红色。,染色原理,注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液的pH值7.0-7.2较好。染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。

9、,吉氏染液母液配置方法,吉氏染液：吉氏粉5克，甘油250ml，甲醇250ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶中，再次加甲醇洗后倒入瓶中，至洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24h或室温内35天，每天用力摇动5分钟，即成原液。吉氏染液是目前较优良的血膜染剂，能长期保存而不变质。伊红在水溶液内遇到美蓝或天青即可互相化合而产生沉淀，从而失去染色力，因此，吉氏母液绝对不能进水。 整个染色液配制时间不能少于5个小时。,吉氏染液的染色方法,成批血片染色：将已固定薄血膜的血片

10、插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或蒸馏水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾片板上晾干，包装，镜检。单张血片染色：取蒸馏水或缓冲液1ml加入吉氏原液1滴，混合均匀后涂在厚、薄血膜上，染色30分钟左右，然后用清水轻轻将载玻片上的染液冲洗干净，晾干镜检。（勿直接倾倒掉玻片上的染液，防止渣滓附着在玻片上冲不掉影响镜检）注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.,操作1 （快染） 配制8%10%，染色时间短，一般为15min左右，一定掌

11、握好时间。 操作2 (慢染)配制3%4%染液，染色3040min，效果稳定。随具体情况而定。,吉氏染液浓度,门诊染色,影响染色效果的因素,血片染色好坏除与玻片清洁度、血片制作质量和染色技术等有关外，还受到以下因素的影响： （1）染剂、溶剂的质量 染料、甲醇和甘油必须用分析纯，且在配制时所用的器具必须干净且无水份。 （2）染液的新旧 染液存放时间越久，染色力越强。新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密，以防吸潮而影响染液质量。 （3）染液稀释后使用时间 必须现用现稀释染液，当时使用，一般在0.5h内染色力最强。 吉氏和瑞氏

12、染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。,影响染色效果的因素,（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高，着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。 （5）染色时间 染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。 （6）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择pH6.8-7.2清洁水，通常使用新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水。 （7）冲洗方法 应沿玻片或

13、染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。,血片制作与染色注意事项,使用前载玻片一定要清洁，否则会影响血片制作和镜检结果。 厚血膜干燥时勿加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果。 配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。 固定薄血膜时勿将甲醇触碰到厚血膜。 冲洗染液时，水流轻缓，勿冲走厚血膜。,1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。 2.镜检疟原虫，首先学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，再学习镜检厚血膜。 3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时参考和血片编号之用。 4.镜检疟

14、原虫须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当发现疑难问题时再调换10X目镜进行观察。 5.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至右（或由右至左），一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序地查完整个血膜。一般情况下，厚血膜四周（稍薄些）疟原虫数量较多，且形态较清楚，镜检时不要忽略。每张厚血膜检查时间最少不低于20分钟。,血片的镜检,看完血片后，若为阳性，应立即按血片编号登记原虫的种、期，以防差错。为检查后记录结果方便起见，对疟原虫的种、期可使用英文字母缩写作为代号：间日疟： Pv (Plasmodium vivax) 恶性疟： Pf (Pfalciparum)三日疟： Pm (Pmalarae

15、) 卵形疟： Po (Povale)环状体： R (Ring form) 大滋养体：T (trophozoite)裂殖体： S (Schizont) 配子体： G (Gametocyte),原虫密度计算,估计疟原虫感染程度有三种方法：半定量计数法 检查厚血膜 白细胞原虫密度计数法 检查厚血膜 红细胞感染率计算法 检查薄血膜,用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。 国内常用。此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每

16、个视野不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野15个虫，记录“” 4.平均每个视野610个虫，记录“+” 5. 平均每个视野11100个虫，记录“+ ” 6. 平均每个视野100个虫以上，记录“+ ”。,半定量计数法,白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）,白细胞疟原虫密度计数法重要性, 用于疟疾研究 用于临床诊断 用于抗疟后疟疾考核,在厚血膜，按要求选择视野，计数每个视野中的疟原虫数和白细胞数，一般情况下计数200个白细胞，如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（500 1 000 个）。 白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数 白细胞数 每微升血中白细胞数 = 疟原虫数/微升血。 制作厚血膜的同时计数每微升血中白细胞数，如果无法进行白细胞计数，则以6000个/微升血计算。 (国际标准为8000个/微升血) 。,