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1、全血基因组DNA的提取,分子生物学检验技术,研究对象,DNA及RNA,其表达产物蛋白质,探讨生命现象,以超乎想象的速度飞速发展，渗透到医学每一个领域。,使疾病诊断深入到基因水平,可以毫不夸张的说，如果没有分子生物学的应用，人类探索生命活动的行为将会寸步难行。,分子生物学检验技术的应用,本学期实验内容,理论考试占70%，实验成绩占30%,实验一 全血基因组DNA的提取,基因组（Genome）：细胞中一套完整单 倍体的遗传物质的总和。,原核生物基因组 病毒基因组 真核生物基因组,真核基因组DNA的分离纯化,（1）核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都 以与蛋白质结合的状态存在。（2）真核生物的
2、染色体DNA为双链线性分子；,分离核酸注意事项：,（1）减少化学因素对核酸的降解。 （2）减少物理因素对核酸的降解。 （3）防止核酸的生物降解：策略：新鲜生物组织或细胞样品。,核酸提取的主要步骤：,一般为破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。,一、实验目的与意义,（一）目的：掌握全血DNA提取基本技能。 （二）意义：基因组DNA含有细胞中全部的遗传信息，从全血中提取DNA是遗传性疾病、胎儿产前无创伤诊断、肿瘤和传染性疾病等的早期确诊的重要手段和技术，DNA提取的质量和产量直接影响PCR扩增、分
3、子克隆、限制性内切酶的酶切反应等试验的成败。,（三）常用提取方法：有机溶剂抽提法（氯仿-异戊醇法）盐析法（经典Miller盐析法）NaI法,NaI法提取外周血白细胞DNA，提取的DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列。通过本实验学习和掌握NaI法提取DNA。,二、实验原理,从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全，DNA存在于上层水相中，以异丙醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，70%酒精干燥，即可获得白细胞DNA。,1、高速离心机。 2、全血DNA提取试剂盒（
4、TaKaRa宝生物工程公司） 试剂盒组成： GenTLE solution 1瓶GenTLE solution 2瓶GenTLE solution 1瓶 3、异丙醇、70%乙醇。,三、实验材料,各试剂成分作用：,GenTLE solution ： 破坏血细胞同时，与核酸形成电中性的复合体。,GenTLE solution ： 复合体离心收集后清洗，洗涤作用。,GenTLE solution ： 将DNA从核蛋白中解离出来。,异丙醇：将DNA沉淀回收。,70%酒精：利用DNA不溶于酒精的特性，去除DNA沉淀中残留的盐类分子。,四、实验流程与要求,经各种抗凝剂处理过的全血 （EDTA、柠檬酸或肝素
5、）,按试剂盒说明书操作。见后,1、琼脂糖凝胶电泳初步鉴定；,2、测定DNA浓度及纯度；A260/A280比值,（1）,（4）,12,000rpm离心5min(20以上离心),将上清转移至另一个新的离心管中,412,000rpm离心5min，小心去除上清，加入1ml的70%乙醇清洗沉淀， 再次412,000rpm离心5min，小心去除上清并干燥沉淀。,沉淀的溶解：加入30ul DH2O（或TE缓冲液）。,琼脂糖凝胶电泳,0.3g琼脂糖+30ml 0.5TBE缓冲液， 加热至完全溶化且摇匀，温度适宜时 加入荧光染料。,将样品梳插于内槽，并将制胶槽平放 在桌上，将冷却至60度的琼脂糖凝胶 缓缓倒入槽
6、内，使其形成均一胶面， 勿起泡。胶凝固后垂直取出梳子， 将制好的胶板置入电泳槽内，并加入 电泳缓冲液。,凝胶电泳操作注意事项,1.缓冲系统：注意缓冲液的使用是否正确。 2.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一 致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 3.样品加入量：加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。,5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。,五、实验结果,在凝胶成像系统中紫外灯观察拍照（戴手套操作）。DNA存在处显出桔红色荧光条带（EB染料呈现桔红色）。,谢谢！,
