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1、全血基因组DNA的提取,分子生物学检验技术,研究对象,DNA及RNA,其表达产物蛋白质,探讨生命现象,以超乎想象的速度飞速发展,渗透到医学每一个领域。,使疾病诊断深入到基因水平,可以毫不夸张的说,如果没有分子生物学的应用,人类探索生命活动的行为将会寸步难行。,分子生物学检验技术的应用,本学期实验内容,理论考试占70%,实验成绩占30%,实验一 全血基因组DNA的提取,基因组(Genome):细胞中一套完整单 倍体的遗传物质的总和。,原核生物基因组 病毒基因组 真核生物基因组,真核基因组DNA的分离纯化,(1)核酸包括DNA、RNA两种分子,在细胞中都 以与蛋白质结合的状态存在。(2)真核生物的
2、染色体DNA为双链线性分子;,分离核酸注意事项:,(1)减少化学因素对核酸的降解。 (2)减少物理因素对核酸的降解。 (3)防止核酸的生物降解:策略:新鲜生物组织或细胞样品。,核酸提取的主要步骤:,一般为破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质,最后得到纯化的核酸。,一、实验目的与意义,(一)目的:掌握全血DNA提取基本技能。 (二)意义:基因组DNA含有细胞中全部的遗传信息,从全血中提取DNA是遗传性疾病、胎儿产前无创伤诊断、肿瘤和传染性疾病等的早期确诊的重要手段和技术,DNA提取的质量和产量直接影响PCR扩增、分
3、子克隆、限制性内切酶的酶切反应等试验的成败。,(三)常用提取方法:有机溶剂抽提法(氯仿-异戊醇法)盐析法(经典Miller盐析法)NaI法,NaI法提取外周血白细胞DNA,提取的DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列。通过本实验学习和掌握NaI法提取DNA。,二、实验原理,从全血制备白细胞DNA,可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜,释放出血红蛋白及细胞核,使核酸处于易提取状态,加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离,用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全,DNA存在于上层水相中,以异丙醇沉淀DNA,离心弃去异丙醇,70%酒精干燥,即可获得白细胞DNA。,1、高速离心机。 2、全血DNA提取试剂盒(
4、TaKaRa宝生物工程公司) 试剂盒组成: GenTLE solution 1瓶GenTLE solution 2瓶GenTLE solution 1瓶 3、异丙醇、70%乙醇。,三、实验材料,各试剂成分作用:,GenTLE solution : 破坏血细胞同时,与核酸形成电中性的复合体。,GenTLE solution : 复合体离心收集后清洗,洗涤作用。,GenTLE solution : 将DNA从核蛋白中解离出来。,异丙醇:将DNA沉淀回收。,70%酒精:利用DNA不溶于酒精的特性,去除DNA沉淀中残留的盐类分子。,四、实验流程与要求,经各种抗凝剂处理过的全血 (EDTA、柠檬酸或肝素
5、),按试剂盒说明书操作。见后,1、琼脂糖凝胶电泳初步鉴定;,2、测定DNA浓度及纯度;A260/A280比值,(1),(4),12,000rpm离心5min(20以上离心),将上清转移至另一个新的离心管中,412,000rpm离心5min,小心去除上清,加入1ml的70%乙醇清洗沉淀, 再次412,000rpm离心5min,小心去除上清并干燥沉淀。,沉淀的溶解:加入30ul DH2O(或TE缓冲液)。,琼脂糖凝胶电泳,0.3g琼脂糖+30ml 0.5TBE缓冲液, 加热至完全溶化且摇匀,温度适宜时 加入荧光染料。,将样品梳插于内槽,并将制胶槽平放 在桌上,将冷却至60度的琼脂糖凝胶 缓缓倒入槽
6、内,使其形成均一胶面, 勿起泡。胶凝固后垂直取出梳子, 将制好的胶板置入电泳槽内,并加入 电泳缓冲液。,凝胶电泳操作注意事项,1.缓冲系统:注意缓冲液的使用是否正确。 2.凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一 致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,影响电泳结果。 3.样品加入量:加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。,5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移,加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。,五、实验结果,在凝胶成像系统中紫外灯观察拍照(戴手套操作)。DNA存在处显出桔红色荧光条带(EB染料呈现桔红色)。,谢谢!,