《技术在乙型肝炎病毒（hbv）感染研究中的应用课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《技术在乙型肝炎病毒（hbv）感染研究中的应用课件（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、ELISPOT技术在乙型肝炎 病毒（HBV）感染研究中的应用,首都医科大学附属北京佑安医院闫惠平 研究员，博士生导师,Margolis HS et al. Semin Liver Dis 1991; 11: 8492.,乙肝病毒携带者流行分布 (3.6亿慢性乙肝病毒携带者):, 8% 高流行区,乙肝病毒携带者的流行分布,HBsAg流行率在中国的地区分布,江西,山西,重庆,HBsAg流行率,黑龙江,吉林,辽宁,内蒙古,北京,天津,河北,山东,江苏,上海,浙江,台湾,福建,广东,海南,广西,云南,贵州,四川,西藏,新疆,青海,甘肃,宁夏,陕西,河南,湖北,湖南,安徽,1992年全国病毒性肝炎血清流
2、行病学调查,8% 高流行区,2%7% 中度流行区,HBV 携带者全球性分布,HBs Ag 携带者的分布10% 少见,HCC 每年发病率,每 100,000 人1-3 3-10 10-150 少见,HBV 携带者地理分布与肝细胞癌(HCC)发病率,HBV感染的流行情况及其严重性,全世界HBV 感染者: 3.6亿中国HBV感染者: 1.3亿(2004年流行病学调查，HBsAg阳性率为8.22,接种乙肝疫苗人群为4.51，非免疫人群为9.51)。 慢性乙型肝炎: 3 000 万- 5年后，约12%-25%发展为肝硬化,约20-23%发展为失代偿肝硬化。约6%-15%肝硬化可发展为肝细胞癌(HCC)-
3、 国内80%肝细胞性肝癌与HBV感染相关 每年死于乙肝相关肝病及肝癌约30-50万人Adapted from Feitelson. Lab Invest, 1994, and from EASL Consensus Statement. J Hepato, 2003, 39 (S1):S3-25,HBV infection,急性肝炎 慢性肝炎 重型肝炎（急性、亚急性、慢性） 慢性HBV携带者 乙肝后肝硬化 原发性肝癌隐性感染(既往感染),HBV实验室诊断,生化：ALT， AST，Tbil， ALP， TP等 凝血： 病原学检测：HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBcHBV
4、DNA 缺少细胞免疫功能监测指标,ELISPOT-细胞免疫学技术,从单细胞水平检测分泌抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞, 从单细胞水平评价机体的细胞免疫或体液免疫功能 不仅适用于特异性T细胞应答的检测 也可用于特异性B细胞应答的分析,ELISPOT技术的应用,疫苗研究 HBV疫苗：疫苗的免疫原性；疫苗的治疗效果；疫苗的给药途径；不同病人的敏感性 肿瘤疫苗：抗肿瘤甲胎蛋白和热休克蛋白DNA疫苗；肝癌疫苗； 抗原表位筛选： 丙肝CTL表位；用肽库筛选T细胞表肽；自身免疫病研究、诊断 器官移植 肝移植 ：肝移植免疫耐受;,ELISPOT-在HBV细胞免疫中的应用,抗原表位肽的筛选,某些肽段有保护作用?
5、 感染后细胞免疫功能的检测,判断乙肝病人在病程中所处的免疫状态（急性期、平稳期、耐受期、恢复期）,是否具有清除病毒的能力?抗病毒治疗疗效监测,有无应答?停药后是否会反跳等;器官移植后排斥反应的预测。 -但是目前能够清楚说明临床问题的报道很少,乙 肝 病 毒,HBV的感染及复制过程,HBV cccDNA,每个感染肝细胞核中含3040cps，形成稳定的 cccDNA 池 (Minichromosome)当前尚无任何药物能直接作用于cccDNA抑制HBV复制的药物即使长期应用很难清除 cccDNA Blackberg J et al. J Hepatology 2000; 33(6):992 Kom
6、ori M et al. J Hepatology 2001; 35(6):798Lewin S et al. Antiviral Research 2002; 55:381,佑安医院初步研究,研究目的通过观察乙型肝炎病毒（HBV）特异性多肽刺激外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN-的能力，分析慢性乙型肝炎患者、慢性乙型重型肝炎患者及隐性感染者体内特异性T细胞免疫应答的差异和作用。,材料和方法,病例分组 慢性乙型肝炎组（CHB）20例 慢性乙型重型肝炎组（CSH）10例 正常对照组1（N1，隐性HBV感染者）6例 正常对照组2（N2，正常献血员） 10例,研究方法,合成四条HLA-A2限制的
7、HBV特异CTL抗原表位肽作为刺激抗原。 表面抗原蛋白Te28-39（简称Te1） 表面抗原蛋白Te183-191（简称Te2） 多聚酶蛋白Tp573-581（简称Tp） 核心抗原蛋白Tc18-27（简称Tc） 采用酶联免疫斑点（ELISPOT）技术检测抗原表位特异性T细胞的免疫应答功能。,结果1：HLA-A2基因表型检测结果,HLA-A2基因表型检测结果（流式细胞技术直接免疫荧光法） 左图为HLA-A2阴性结果，右图为HLA-A2阳性结果,结果2：抗原特异性CTL应答功能检测结果及分析,ELISPOT实验结果图,抗原特异性CTL对肽的反应结果,只要对任何一条肽刺激产生IFN-的阳性斑点者即计
8、为反应阳性者。CHB组，阳性率为50%（10/20）CSH组，阳性率为10%（1/10）N1组， 阳性率为83.3%（5/6）N2组， 阳性率为10%（1/10） N1组对肽反应的阳性率显著高于CSH组(P=0.008)和N2组(P=0.008) 。,HBV特异性抗原表位肽在组内的应答差异,采用Fishers 确切概率法，组间两两比较，*表示N1组对Tp抗原表位肽、对Te1抗原 表位肽和对Tc抗原表位肽反应的阳性率高于CSH组(P0.008)和N2组(P0.008)。,四条肽对不同分组PBMC的刺激作用,各组研究对象对各条肽的应答情况,HBV特异性抗原肽平均反应强度的比较结果,经秩和检验，N1
9、组对四条肽的平均反应强度大于CHB组、CSH组和N2组，P0.01。,HBV隐性感染者特异性免疫应答能力强于CHB组和CSH组，尤其是HBsAg肽在HBV清除后依然可使机体产生很强的细胞免疫反应。这可能是其能够依靠自身免疫功能清除病毒的主要原因。,抗原特异性CTL应答功能结果分析,慢性乙型肝炎患者细胞免疫应答较弱，而慢性乙型重型肝炎患者这种应答反应更是缺乏。表明患者很难依靠自身的免疫能力清除体内感染的病毒。 ELISPOT方法体外检测T细胞产生IFN-的能力有可能作为判断机体抗病毒能力的细胞免疫指标。,乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临床疾病状态的关系,研究对象： HLA
10、-A24阳性患者：急性乙型肝炎 7例慢性乙型肝炎 13例 HLA-A24阴性患者： 急性乙型肝炎 6例慢性乙型肝炎 17例 PBMC用HLA*2402HBV肽链四聚体复合体染色 流式细胞仪检测HBV特异性CTL细胞, ELISPOT技术检测部分患者的CTL细胞分泌IFN-的水平。,范振平等，中华医学杂志,2004,84(24):2073-2076,结果:在7例急性乙型肝炎的急性期,-高水平的HBV特异性的CTL细胞,急性乙型肝炎的恢复期,HBcAg特异性CTL细胞的水平可以明显下降，13例慢性乙型肝炎患者中,除了1例慢性肝炎急性暴发患者之外,均不能检测到HBcAg特异性CTL细胞IFN的分泌。
11、结论：急性肝炎患者中的PBMC中有高水平的HBV特异性CTL细胞,这些细胞可能与控制乙型肝炎病毒的复制及病毒的清除有关。,范振平等，中华医学杂志,2004,84(24):2073-2076,乙型肝炎患者特异性细胞免疫功能 检测的初步研究,研究目的 通过酶联免疫斑点法检测乙型肝炎患者特异性细胞免疫功能,初步研究各型乙肝患者特异性细胞免疫功能的差异。赫兢，辛绍杰等，中华实验和临床病毒学杂志,2006 , 20 (1 ):33-35,材料和方法,病例分组（每组4例） 急性乙型肝炎组 慢性乙型肝炎组 肝炎肝硬化（乙型） 乙肝病毒 (HBV) 既往感染 接种乙肝疫苗后血清乙肝病毒学标志中仅表面抗体阳性及
12、未接种过乙肝疫苗组 血清HBV 标志全部阴性者,研究方法：,根据文献报道,设计合成HBV 表面抗原(HBsAg) 3 条主要抗原决定簇表位多肽,分别长912 个氨基酸,采用酶联免疫斑点法( ELISPOT) 检测各组研究对象的外周血单个核细胞中-干扰素分泌细胞的数量。,结果,ELISPOT检测各型乙肝患者的SFC 数值,急性乙肝患者、慢性乙肝患者及急性乙肝患者、肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞-干扰素分泌细胞数量明显不同( P = 0.0209 及P =0.0211),存在问题,ELISPOT技术: 操作步骤多,复杂,难以标准化 新鲜细胞和冻存细胞差异 HBV研究方面: 观察病例少, 领域少；没
13、有系统长期的观察研究报道；没有全基因多肽的系统研究。,ELISPOT应用前景,临床迫切需要 操作步骤需要简化, 建立参照标准 操作向自动化改进,NH2,C,S,E,NP,ORF1-11,COOH,M,1,2,4,3,5,6,7,8,9,10,11,12,Overlapping peptides for SARS T cell epitopes,2000,15 aa overlapping by 10 aa,M,E,N,Orf 3,Replicase,Spike,Orf 4,Orf 14,Orf 13,Orf 7,Orf 8,Orf 9, 10, 11,Distribution of T cell epitopes,% recognition at population level,联系方式,北京右安门外西头条8号 北京佑安医院 100069 010 63296484 Email:,谢谢,
