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1、西西南南大大学学研研究究生生课课程程考考试试答答 卷卷 纸纸考考试试科科目目 现现代代 兽兽医医 诊诊断断学学 院院 、所所、中中心心 动动 物物 科科 技技 学学 院院 专专业业或或专专业业领领域域 兽兽医医专专业业硕硕士士 研研究究方方向向 临临床床兽兽医医 级级 别别 2 0 0 9 学学 年年 2010 年年 学学 期期 第第一一学学期期 姓姓 名名 廖廖 天天 利利 学学 号号 122009328050008 类类 别别 兽兽医医硕硕士士 （ （全全日日制制博博士士 全全日日制制硕硕士士 教教育育硕硕士士 高高师师硕硕士士 工工程程硕硕士士 农农推推硕硕士士 兽兽医医硕硕士士 进进修
2、修)2010 年年 11 月月 05 日日研研 究究 生生 院院 (筹筹 )制制课课 程程 类类 别别必修必修课课课程考试方式课程考试方式课课程程论论文文题号题号得分得分教教 师师 评评 价价一一二二三三四四五五六六七七八八九九十十总分总分任课教师签名：任课教师签名：备注：备注：成成绩绩评评定定以以百百分分制制或或等等级级制制评评分分，每每份份试试卷卷均均应应标标明明 课课程程类类别别（必必修修课课选选修修课课同同等等学学力力补补修修课课）与与考考核核方方 式式（闭闭卷卷笔笔试试口口试试开开卷卷笔笔试试课课程程论论文文） 。课课程程论论文文应应 给给出出评评语。语。文献综述寄生虫感染实验室检验
3、寄生虫感染实验室检验摘要：摘要：寄生虫病目前仍是人畜共患的重要疾病。但近年来，人们逐渐忽略了对寄生虫的检测，近期我国发生了一系列由寄生虫感染造成的公共安全事件，甚至造成严重的后果，让人们又重新去审视这类人畜共患疾病。本文对寄生虫的主要实验室检验技术进行了综述。 关关键词键词：寄生虫；感染；实验室检验寄生虫是一病原生物体，如单细胞生物(原虫)或蠕虫等，它们通常寄生于比其大得多的生物体(宿主)内。寄生虫病目前仍是人畜共患的重要疾病，但随做环境卫生的不断改善，寄生虫病例的减少，人们逐渐忽略了对寄生虫病的关注，对寄生虫的检测也相应减少。近年来，北京的“食用福寿螺感染寄生虫”事件、广东的肝吸虫感染事件等
4、一系列严重危害公共安全的寄生虫病感染，让人们再一次引起对寄生虫病的高度关注。本文对寄生虫的主要实验室检验技术进行了综述。 1 寄生虫感染实验室诊断寄生虫感染实验室诊断 检验临床标本中的病原体，诊断寄生虫感染，通常采用最多的是形态学标准，而不是用生化手段、培养及虫体生长特性。最终的寄生虫鉴定经常依靠浓集和(或)染色标本的显微 镜分析，通常在油镜下(l000)观察，在一定程度上依赖于显微镜观察者的技术，原虫体积很小，有些是细胞内寄生的，需要大量分离和染色才能鉴定。蠕虫感染一般通过在各种临床标本、主要是肠道样本中发现虫卵、幼虫和(或)成虫予以诊断。 11 病原检查病原检查在寄生虫感染中，检查出寄生虫
5、病原体是确诊的依据。根据临床诊断提供的线索，通过标本的采集、处理、检验、分析等，做出明确结论，为临床治疗和流行病学调查提供可靠的依据。根据寄生虫的种类、在人体的发育阶段和寄生部位的不同可采集相应的标本(粪便、血液、阴道分泌物、尿液、痰液、组织活检或骨髓穿刺等)，采取不同的检查方法。对于肉眼可见的大部分蠕虫和节肢动物，根据其标本来源和形态特征可作出初步判断，如粪便中的蛔虫、蛲虫、绦虫节片、组织中的蝇蛆等；对于原虫等肉眼无法见到的小型寄生虫，如阿米巴原虫、阴道毛滴虫、疟原虫、各种蠕虫的卵、疥螨、蠕形螨等则须借助显微镜观察1。病原体检查的质量取决于检验医生的责任感和对寄生虫的形态、生活史、致病等基本
6、知识和基本技能的掌握程度。12 免疫学检查免疫学检查 有些寄生虫病难以根据症状或体征及病原检查作出诊断，此时需采取免疫学方法辅助诊断。在感染早期、轻度感染、单性感染(仅有雄虫)、隐性感染或由于特殊的寄生部位而使病原检查十分困难以及在流行病学研究中，免疫诊断具有突出的优点。所用的抗原包括同种抗原、生活史某期特异性抗原或基因工程抗原。根据反应原理分为皮内反应和血清学试验(沉淀反应，凝集反应和标反应)。检测物质包括特异性抗体、循环抗原、免疫复合物。近年来也有学者检测细胞因子以了解机体的免疫状态、抗虫感染的免疫机制或作为疗效评价的参考。此外，嗜酸性粒细胞计数和嗜碱性粒细胞脱颗粒试验也可用于蠕虫感染的辅
7、助诊断。近年发展起来的蛋白质芯片技术可望为寄生虫感染的免疫诊断带来又一技术突破。13 分子诊断分子诊断 检测的靶物质为寄生虫基因组中特异性的 DNA 片段。例如根据碱基互补原理可设计并标记 DNA 探针(probe)进行原位杂交(insitu hybridization)；也可设计合成引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，扩增样本中微量的 DNA 片段。将免疫检测技术与基因扩增技术嫁接而创立的 PCRELISA，用于疟原虫的检测，最低可测阈值为 0001的原虫密度本世纪之交发展起来的 DNA 微阵I(DNA microarray)，或称 DNA 芯
8、片(DNAchips)技术通过高通量、自动化的 DNA 杂交检测，可在一张芯片上同时检测成千上万个DNA 片段，将为包括寄生虫病在内的感染性疾病和遗传性疾病的基因诊断带来一场革命。理论上，检测某种寄生虫的特异性 DNA 片段与检测虫体具有同样的诊断价值2。 2 粪便寄生虫感染检验方法粪便寄生虫感染检验方法 21 直接涂片法直接涂片法(direct smear method) 目的是确定某些原虫和蠕虫感染的可能性、估计病人的虫负荷、观察虫体的运动。任何没有冷冻的、在特定时间内送到实验室的新鲜粪便标本都可以接收并检验。送到实验室的防腐保存的粪便标本在浓集和永久染色涂片之前不必要做直接涂片检查3。常
9、用方法有生理盐水涂片法和碘液染色涂片法，前者适用于检查各类原虫的滋养体和蠕虫卵，后者适用于检查原虫的包囊。为获得较准确的结果，每份粪便应做 3 张涂片此法简便快速，但粪便用量少，易于漏诊。由于仅用生理盐水直接涂片法来证实虫体比较困难，因此，当有足够的样本以供永久性染色涂片时，才采用本技术。用直接涂片法，在低倍镜下(放大 100 倍)要查看全部盖片，高倍镜下(放大400 倍)至少要查看盖片的 l3，如无虫体，才能确定结果为阴性。 211 检查蠕虫卵检查蠕虫卵 用生理盐水直接涂片法。于载玻片近中央处滴加生理盐水 12 滴，用牙签挑取粪便少 许，放于生理盐水中搅匀后摊开，涂成均匀的薄粪膜，覆以盖片，
10、置镜下检查。生理盐水的滴加量视粪便的稠、稀而定，粪膜厚薄以透过粪膜赂能辨认其下面报纸的字迹为度4。虫卵的辨认依据形状、大小、颜色、卵壳及卯盖、内含物等特征，并注意与粪便残渣和食人的酵母菌真菌、花粉、植物纤维、油滴等异物加以区别5。 212 检查原虫检查原虫 (1)活滋养体检查：方法同蠕虫卵的检查，但粪便必需新鲜，以豹液血便虫体较多，涂片要薄而均匀。虫体适应涂片处理需要几分钟时间，几分钟内，虫体的运动不明显，然后，可以看到滋养体伪足移动、鞭毛挥动，运动渐趋活泼，无色。由于可能存在上皮细胞、巨噬细胞、多形核白细胞和红细胞，需要仔细检查以寻找阿米巴。滋养体的活动与环境温度有关，气温较低时，须将载片和
11、生理盐水略加温后再涂片，最好在装有保温台保持恒温的显微镜下观察6。(2)检查包囊：以碘液代替生理盐水滴加于载玻片上，挑取米粒大小的粪便置于碘液中，调匀涂片，加盖玻片7。也可先制备生理盐水涂片，加盖玻片，然后在盖玻片一例边缘加 l 滴碘液，使其渗人生理盐水涂片。这样，一侧粪膜染成浅黄色，另一侧仍保持原色，既便于比较，又可同时检查包囊和滋养体。碘液涂片中，溶组织内阿米巴包囊呈黄色或黄绿色，糖原泡呈棕红色，囊壁、核仁和拟染色体均透明无色。蓝氏贾第鞭毛虫包裹，椭圆形，二核或四核常在一端，鞭毛卷曲发亮。迈氏盾鞭毛虫，包囊柠檬形，一核，一胞口。等胞球虫卯囊椭 圆形，成熟卵囊内含孢子囊 2 个，每个孢子囊各
12、含 4 个子孢子，一个残国体，无囊塞(stiedabody)。 碘液配制：碘化钾 48g，溶于 100mL 蒸馏水中，再加入碘 28g，溶解后贮于棕色瓶中备用8。 22 厚涂片透明法厚涂片透明法(加藤法加藤法 Katos method) 该方法适用于检查蠕虫卵。将 l00 目时的尼龙或金属网(大小约 4cm x 4cm)覆盖在粪便标本上，用刮棒自网上刮取挤送到网面上的粪便约 50m8，置于载玻片上。用浸透甘孔雀绿溶液的亲水玻璃纸条覆盖在粪条上，上面用橡皮塞轻压，使粪膜铺开成 20mm25mm 大小长椭圆形，置 3O36温箱中，约30min 粪膜透明后镜检。如在 24毫温中 U 需 l15h。掌
13、握粪膜厚度和透明时间对于虫卵的辨认非常重要，钩虫卵不宜透明过久。玻璃纸的制备：将玻璃纸剪成大小约 22ram30mm 的小片，浸泡于甘油孔雀绿液(3孔雀绿 lml，甘油 100mL，水 l00ml)中 24h 以上，使玻璃纸浸透呈绿色即可使用9。 23 定量透明法定量透明法(Kato-Katz 虫卵计数法虫卵计数法) 此法即改良加藤法(modified Kat。 sthick smear)，适用于各种粪便内蠕虫卵的检查及计数。通过计数虫卵，估测虫负荷，对确定感染密度、指导化学疗法、评估疗效有一定参考作用。 此法系应用改良聚苯乙烯作定量板，大小为 40ram30mm X 137mm，模孔为一长圆
14、孔，大小为 8nmi4mm，两端呈半圆形，所取的粪样平均为417rag。操作时将大小约 4cm 4cm 的 100 目尼龙网或金属筛网覆盖在粪便标本上，自筛网上用刮片刮取粪便，置定量板与载玻片上，用左手的两指压住定量板的两端，将刮片上的粪便填满模孔，刮去多余粪便。掀起定量板，载玻片上留下一个条形粪样，然后在粪条上覆盖含甘油一孔雀绿溶液的大小约为5025cm 的玻璃纸条，展乎后加压，使玻璃纸下的粪便铺成长椭圆形；经l2h 粪便透明后置镜下计数。将所得虫卵数24，再乘上述粪便性状系数，即为每克粪便虫卵数(e88s per 8ram，EPG)常见蛹虫每条雌虫每天排卵数10。 3 结语结语 近年来国内
15、外发展起来的高新技术方法，如单克隆抗体技术(McAb)、免疫印渍技术、DNA 探针技术和基因扩增技术等，为寄生虫病的诊断或寄生虫虫种分类提供新的途径，有广泛应用前景。参考文献：参考文献：1许炽螵寄生虫病实验诊断的进展J中华检验医学杂志，2006(7) 2叶彬，陈雅棠寄生虫病实验室诊断研究进展J中国实用内科杂志，2002(1) 3寄生虫病J中国医学文摘儿科学，2004(6) 4孙惠珍，常正山，邱持平，等从寄生虫病咨询看加强健康教育的必要性J中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2004(2) 5国外医学寄生虫病分册，2005(2)6尹燕双寄生虫检验技术M北京:：人民卫生出版社，2002(7)7曾宪芳寄生虫学和寄生虫学检验M北京：人民卫生出版社，1997(5)8徐元章寄生虫学及检验技术M济南：山东科学技术出版社，1999(3)9仇锦波寄生虫学检验第二版M. 北京：人民卫生出版社，2003 (7)10白功懋寄生虫学和寄生虫学检验M北京：人民卫生出版社，2001(5)
