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1、Western blot 技术原理及 常见问题分析,东胜创新 科学仪器部 2014.7,Western Blot简介及原理Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析,Western Blot 简介：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析
2、称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,Western Blot 基本原理,Western Blot 优点,高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白,Western Blot应用,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析,蛋白表达分析-定性,两种蛋白（47kDa和55kDa)的诱导表达分析诱导剂：Q23和Q70温度：33和39时间：7天、14天、21天,蛋白表达分析-相对定量,示例2,示例1,蛋白表达分析-绝对定量,蛋白相互作用研究,Western Blot 流程,蛋白样
3、品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,蛋白样品的变性,2SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。 按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量2050g。,SDS(十二烷基硫酸钠 )：,阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,不连续的电泳
4、缓冲体系。 SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶成分,丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺 神经毒素！ SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 神经毒素！ 过硫酸铵(AP） 神经毒素！ Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶浓度与蛋白分离范围,SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表：http:/ 隔绝空气,ddH2O 0.1%SDS:8%,灌制浓缩胶 插入梳子,样品,加样槽,蛋白质分子的迁移方向,1 2 3 M,电泳之后凝胶染色扫胶,注意： 做western blot通常用预染Mark
5、er！,转膜,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。,转移膜的选择,最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。各种膜的详细特点介绍： http:/ 1.胶在负极，膜靠近正极 2.保证每层之间没有气泡 3.转
6、膜过程产生大量热量，需冰浴,夹板海绵 滤纸 凝胶 膜 滤纸 海绵,正极,负极,半干转印系统,注意： 防止短路！,转膜后检测（此步可以省略）,丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。,封闭,作用：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 封闭剂：5%脱脂奶粉或BSA，或3%明胶溶于TBSTWestern Blot 膜封闭液（生物试剂公司）,室温孵育1h或4过夜,注：Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体
7、与抗原的结合。,一抗、二抗孵育,1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min。 3.加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 4.用TBST漂洗膜3次，每次5-10min。 5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 6.加入显色底物进行显色反应。,不同标记的二抗及成像方法大PK,125I标记的抗体 X-光片压片显色荧光基团标记的抗体 凝胶成像仪,酶标抗体 ：如HRP（辣根过氧化物酶）、AP（碱性磷酸酶）等成像方法：加酶的底
8、物产生化学发光反应,不同标记的二抗及成像方法大PK,两种常用检测酶系统的比较,显色反应：HRP敏感物TMB，CN，DAB等底物优点：方便、便宜，直接成像缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测,辣根过氧化物酶（HRP）标记 化学发光示意图,碱式磷酸酶（AP）标记 化学发光示意图,化学发光显色：目前使用最多的方法标HRP二抗加ECL底物化学发光反应优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测,灵敏度：MicroChemi 胶片曝光,压片 vs. CCD成像,(1)压片,(2)显影,(3)定影,(4)晾干,(5)存储,1小时-1天,1
9、-10分钟,成像仪与 传统X-光片显影,暗室操作过程,压片实例,压片：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在胶片上标出Marker的大概位置,CCD成像 动态范围大，能直接叠加Marker，便于后期图像的处理及分析,Marker直接叠加在化学发光图像上 Western Blot化学发光成像,特推荐东胜创新经营DNR公司MicroChemi化学发光检测系统，灵敏度高，操作简便功能齐全，价格实惠产品特点：,高灵敏度：超亮大光圈镜头、大尺寸科学级CCD、-60低温制冷三重配置为检测化学发光信号带来高灵敏度、高质量的成像效果 一键拍照：整个拍照过程只需点击一个按钮，即可获得精准高质图像 快速叠
10、加Marker：落射白光实现样品与Marker的准确定位，方便快速在Western的图像上直接叠加Marker 可清洗的样品盘：可完全抽出清洗，避免样品间的交叉污染和实验台面的污染，延长仪器的使用寿命,其他成像方法示例,Western Blot结果分析,目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。分析软件如GelQuant等,Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平？凝胶漏液？,胶玻璃板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底
11、部要对齐,条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？ 条带微弱？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 蛋白浓度不够，加大上样量 蛋白样品是否保存良好，不能反复冻融，提取过程防止蛋白降解,SDS-PAGE电泳,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和凝胶之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,转移到膜上的蛋白很少,背景太高,杂交信号很弱或没有,出现非特异带,谢谢大家！也欢迎大家与我共同讨论和学习！ chunjuan_,
