《161121-血液系统疾病动物模型制备》由会员分享，可在线阅读，更多相关《161121-血液系统疾病动物模型制备（81页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、血液系统疾病动物模型制备、原理及应用,中南大学病理生理学教研室 肖子辉,Contents 一.血栓形成的动物模型 二.DIC的动物模型 三.贫血的动物模型,一.血栓形成的实验动物模型,在活体心血管系统内血液成分形成固体 质块的过程称为血栓形成 (thrombosis)。,血管的止血功能 血液凝固反应 血小板的作用,3机体的止、凝血功能,血管壁的损伤：内皮损伤，内皮下基质( ECM) 裸露 血流状态的改变：血流缓慢或涡流形成 血液性质的改变：高凝状态,血栓形成的机理：,1.兔体外血栓形成模型,造模原理： 血流缓慢或有涡流, 血小板进入边流,增加黏附于管壁的可能性 凝血因子易于在局部堆积和活化，启
2、动凝血过程 血液接触异物能使凝血系统和血小板激活,造模方法：Rabbits anesthetized with intramuscular injections of 5 mg/kg xylazine (甲苯噻嗪) and 30 mg/kg ketamine hydrochloride, maintained diluted ketamine(2 mg/ml, IV) at a rate of 1.53 mg/kg/hrMechanical ventilation via a tracheotomy Body temperature monitored with a rectal probe
3、and maintained at 37C using a water-jacketed heating blanket. Extracorporeal circulation (ECC,4hrs) by cannulating the left carotid artery for ECC inflow and left femoral vein（or right external jugular vein） for ECC outflow,15cm，1/4 inch polyurethane catheter,15cm，1/4inch 亚安酯 catheter,8cm，3/8inch聚亚安
4、酯 catheter,颈总动脉,股静脉,造模方法,Platelet aggregation using a Chrono-Log optical aggregometer.Obtain PRP and PPP by centrifugation, 100% light transmission set by PPP and 0% by PRP,模型评估和应用,Flowcytometry detection:Platelet activationP-selectin (CD62P) expression, Activated GP IIb/IIIa (fibrinogen receptor)Le
5、ukocyte activation Monocyte MAC-1 (CD11b/CD18) and CD14 expression Nutrophil MAC-1 and CD14 expressionPlatelet-leukocyte adhesion Platelet marker (CD61, CD42) and leukocyte marker (CD11b), double stained,模型评估和应用,Thrombus quantitation:Circuits removed after 4 hrs on ECCRinsed with normal salineResidu
6、al thrombus in the larger tubing of ECC photographedImage quantitated using Image J imaging software,模型评估和应用,Biomaterials. 2010 Apr; 31(10): 2736.,模型评估和应用,造模原理： 血小板接触粗糙面发生粘附激活 血小板因粘附而激活，因激活而聚集，形成白色血栓,2.大鼠血栓形成模型,造模方法：麻醉后行气管插管分离一侧颈总动脉和另侧颈外静脉（股静脉） 颈总动脉和股静脉之间接三段相连的聚乙烯管,管中充满肝素生理盐水,中段内放一段丝线经一定时间后取出沿丝线形成的血
7、栓,中段丝线,颈总动脉,股静脉,造模方法,模型评估和应用：剥离沿丝线形成的血栓，直接称量血栓,湿重和干重方法简便可靠，应用于检测处理因素（如药物）对血小板粘附和聚集功能的影响,3.兔腹主动脉血栓形成模型,造模原理:损伤血管内膜,使内皮下细胞外基质(ECM)裸露,促使血小板与ECM(主要是胶原纤维)接触而被激活和黏附。同时裸露的胶原纤维激活因子以及损伤的内皮细胞释放出组织因子,启动了内源性和外源性凝血过程,导致血栓形成。,造模方法标记血小板：动物麻 醉后分离一侧 股静脉和 股动脉股静脉 取血20ml,用 111In 标记血小板,从耳缘静脉注入标记好的血小板,损伤内膜：经股 动脉插入 Fogart
8、y (5f ) 气 囊导管至 胸、腹主动脉交 界处, 气 囊充气至80kPa后下拉气囊管10cm,放气后重新插至交界处, 充气下拉,反复6次,撤除导管,结扎动脉,血栓检测：去内 膜后 1小时 静脉注射 0.5% 伊文斯兰5ml, 然后静注过量戊巴比妥钠处死动物,分离主动脉, 截取上端 5cm 胸主动脉和下端10cm均匀兰染的腹主动脉,计数各动脉段的CPM值,充分干燥后称重,计算每克干重动脉段上标记的血小板数 。,造模方法,通过CPM可准确定量受损血管壁上粘附聚集的血小板可评估检测处理因素对血小板粘附和聚集功能的影响应用于血栓机制的研究和抗血栓药物的筛选,模型评估和应用,4.冠状动脉血栓形成模型
9、,造模原理:直流电（ 1.5mA ）刺激颈动脉壁可使血管损伤,血管内膜变得粗糙不平,引起血小板黏附、聚集和释放反应,促进凝血活性；同时，受损内膜暴露胶原纤维激活内源性凝血系统, 还可通过释放组织因子激活外源性凝血系统,导致动脉管腔内逐渐形成肉眼可见的混合血栓。,造模方法,犬经麻醉、人工呼吸、开胸剪开心包膜, 左房插管备注射药物用。分离冠状动脉左旋支, 用1.5mA直流电刺激左旋支6小时以 破坏血管壁,促进血栓形成。同时记录冠脉血流量、动脉血压、心外膜电图。6小时后处死动物并从左心房插管注射20%活性蓝 (1ml/5kg)以测定左室心肌梗塞的大小。观察血栓形成的百分率，并称量血栓重量,模型评估和
10、应用,该模型所形成的血栓组成和形态近似人冠状动脉，适用于冠状动脉急性血栓形成的机制、防治研究。,5.家兔耳缘静脉血栓形成模型,血流速度变慢，促进血液凝固凝血酶使纤维蛋白原转变成纤维蛋白单体凝血酶使XIII激活，后者使纤维蛋白单体转变成纤维蛋白多聚体，导致血液凝固凝血酶激活蛋白C导致tPA释放，后者使纤溶酶原激活凝血酶同时能直接激活纤溶酶，使纤维蛋白多 聚体降解导致血栓溶解,造模原理:,家兔耳缘静脉分离出2cm长的静脉段,用丝线同时结扎远 心端和近心端,并用血管夹夹住两侧分枝以阻止血流流入用针头抽去该段血液,注入凝血酶(20NIH凝血酶单位/毫升)松开血管夹使血液流入,再夹住分枝使静脉段内形成血
11、块撤去血管夹,放开结扎线,用透射光观察血栓消失及血流恢复时间,造模方法：,模型评估和应用,本模型形成的血栓为红色血栓方法简便主要用于溶栓药物溶栓作用的观察。,二.DIC的动物模型,弥散性血管内凝血(DIC)是一种由不同原因引起的以全身性血管内凝血系统激活为特征的获得性综合征，表现为先发生广泛性微血栓形成，继而因大量凝血因子和血小板被消耗（有时伴有纤溶亢进），导致多部位出血、休克、器官功能障碍及微血管病性溶血性贫血。,实验对象：成年家兔，雌雄随机,1.家兔DIC模型的复制,造模原理正常体内循环血液中不含组织因子，当组织损伤或内皮细胞和白细胞激活时，组织因子能释放或暴露于循环血液启动外源性凝血过程
12、。兔脑粉含有组织因子，静脉注射兔脑粉后通过激活外源性凝血途径引起DIC.,兔脑粉浸液的制备： 健康成年家兔安乐处死后,即刻开颅摘取兔脑，除去血管、脑膜和其它结缔组织，用PBS洗净后，置于研钵中伴丙酮研磨成粥状悬液，静置数分钟后弃上清液，再加入丙酮研磨重复前述步骤多次，直至脑组织完全脱水成白色粉末，置4oC保存待用。,造模方法：,称重后，用20%乌拉坦4ml/kg耳缘静脉注射麻醉动物用生理盐水配制4兔脑粉溶液，按2mlkg体重计算兔脑粉溶液，加生理盐水稀释至20m1后，由耳缘静脉缓慢注入（10min）。分别于注入兔脑粉溶液前15min、注入后15min和45min，记录家兔的血压和呼吸，并取血置
13、于有肝素的注射器中，以测定3P试验、PT、纤维蛋白原、血小板计数。,造模方法,复制DIC模型：,凝血酶原时间(PT)测定 P试液配制：取兔脑粉0.2g，加入5ml NS充分混匀，置C37oC恒温水浴箱内孵育1hr，孵育期间用玻璃棒搅拌3至4次，孵育后混匀、离心(1000rpm x 5min）, 取上清液与等量氯化钙（0.025molL）溶液混匀。 取被检血浆0.1ml，置于小试管内放于37水浴中。 取待测血浆0.1ml加入P试液0.2ml，轻轻地侧动，直至液体停止流动或出现粗颗粒，即为凝血酶原时间. 重复3次，取平均值,家兔正常值为68sec。,造模方法,检查急性DIC的几种血液学常规方法：,
14、血小板计数 吸取20l全血加入到0.38ml血小板稀释液中混匀，用滴管将上述混悬液一小滴滴入血球计数板内，静置15min后，用高倍镜计数。数5个方格内之血小板数，乘以1000，即得每立方毫米血小板数。,造模方法,鱼精蛋白副凝实验(3P实验) 取全血置于EP管中，离心（5000rpm x 3min）后，取上清液即血浆。 取血浆0.4ml置于试管中，加入0.1ml 1%硫酸鱼精蛋白液混匀。室温下静置30min后摇动试管，出现白色纤维或凝块者为阳性，均匀浑浊而没有出现白色纤维者为阴性。,造模方法,血清纤维蛋白(原)含量测定(饱和盐水法) 取血浆0.5m1置于12X100mm的试管中，加入饱和氯化钠溶
15、液4.5m1，充分混匀，置于37水浴中孵育3min，取血后再次混匀，用721型分光光度计比色，测定光密度. 以生理盐水代替饱和氯化钠溶液，进行同样操作作为对照。 对照管调零点，测出光密度(波长520mm)后，按下式计算纤维蛋白原含量：测定管光密度1000=mg%0.5,造模方法,动物死后观察各脏器 的 变 化,造模方法,尸检,2. 小鼠DIC模型的复制,Shwartzman reaction : a generalized reaction following two intravenous injections of endotoxin given 24 hours apart and ma
16、rked by widespread hemorrhage, reduced numbers of white blood cells and platelets, renal necrosis, and death of the animalcalled also generalized Shwartzman reaction,造模原理：感染是DIC发生的最常见的原因，而单核吞噬系统功能障碍是DIC发生的重要诱因之一，第一次注射小剂量致敏内毒素能导致单核吞噬系统功能障碍，当24小时后第二次注射亚致死量内毒素即可诱发DIC.,二、实验对象和材料,实验对象：10 Week old, female
17、 C57Bl/6 mice,Two consecutive injections:a low dose endotoxin priming injection of 5 g Serratia marcescens (灵杆菌) LPS (in 40l,Sigma) or sterile saline control (no-priming) was given in the foot (intradermally) 24 h later by an intravenous LPS challenge (300 g Serratia marcescens LPS)(in 100 l). Mice
18、receiving two endotoxin injections will develop a Shwartzman reaction. No-priming controls represent a single-dose endotoxemia model.Mice were sacrificed at baseline levels (t = -24 h), 24 hours after priming (t = 0 h), 2 hours after challenge (t = 2 h) and 6 hours after challenge (t = 6 h). Each group contained 8 mice.,
