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1、临床细菌学检验 与药物敏感试验结果解读,首都医科大学附属北京友谊医院 苏建荣,讲课提纲,标本的采集运送、评价和细菌学检查方法 病原体耐药性检测 药物敏感试验 耐药机制 常见耐药菌的耐药检测,第一部分 标本采集方法,采血时机： 发热初期和高峰期采血 采集部位： 肘静脉或其他部位静脉 采血次数： 23次/ 24h 采血量：成人1020ml,婴儿和儿童15ml,（1）Blood,blOOd bottle,注入血液培养瓶Aerobic bottle Fungal bottleAnaerobic bottle,（2）脑脊液与其他无菌体液,严格消毒采集部位 无菌方法采集标本 可直接接种于血培养瓶中增菌怀疑
2、为脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌感染的标本应该保温运送或床边接种。,对痰质量的评价,细胞数/低倍视野 级别 白细胞 扁平上皮细胞 6 25 25 10253 25 252 1025 25 不合格1 10 25,合格,（4）不适合做厌氧菌培养的标本,有正常菌群存在的部位： 鼻咽拭子 齿龈拭子 会阴部拭子 阴道拭子 宫颈口拭子,第二部分 鉴定方法： 1、全自动微生物系统（AMS-VITEK）,鉴定细菌、真菌和细菌药敏试验,2、病原体抗原检测,用已只抗体检测未知抗原如：乳胶凝集试验（latex coagulation test）检测细菌,凝集,未凝集,3、病原体核酸检测,分子生物学法： PC
3、R、基因芯片 DNA hybridizition技术（军团菌、衣原体、支原体、病毒等） 测序,4、鉴定结果报告及分析 1）、细菌、真菌的种名 2)、尿细菌培养：细菌计数：100-10000-100000 CFU/ml，细菌、真菌的种名 3)、分子生物学法：定性，定量 4)、临床意义：结合临床分析 感染？污染？尿细菌计数G- 100000 CFU/ml G+球菌10000CFU/ml 5)台湾,第三部分 抗菌药物敏感性试验与 病原体耐药性检测,抗菌药物敏感性试验 耐药机制 常见耐药菌的耐药检测,一、抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility test，AST）-
4、简称药敏试验,药敏试验体外检测抗菌药物抑制或杀灭细菌的能力，即检测细菌对抗菌药物的敏感性。,关于CLSI,（一）药敏试验的目的,1、预测抗菌药物治疗的效果？ 抗菌药物 细菌指导临床合理选药,2、更换抗菌药物时,预测拟选药物的疗效 ？,（二）药敏试验用药的选择,选药原则： 根 据美 国CLSI（Clinical and Laboratory standards institute) 抗 微 生 物 药 物 敏 感 试 验 的 执 行 标 准 进 行（简称指南） 。,指南将抗菌药物分成A、B、C、U四组。 A组：常规药敏试验的首选药物。B组：次首选药物，对A组同类过敏、耐药、多细菌感染、多部位感染
5、。流调的需要。,C组：补充性抗菌药物。对数种基本药物耐药菌株或对基本药物过敏者。（氯霉素 肠球菌 ）U组：仅用于泌尿道感染的药物。（呋喃妥因、某些喹诺酮类）。,在 非 苛 氧 菌 中 的 药 物 分 组(A、B、C、U),在苛氧菌中的药物分组（A、B、C）,由表看出： 不 同 种 类 的 病 原 菌 选 择 药 物 种 类 不 完 全 相 同 ( G+、G-菌、非苛氧菌、苛氧菌）选 择 有 代 表 性 药 物 做 药 敏 试 验，在代 表 性 药 物 同 类 中 选 择 一 、两种药物（如何读取检验报告举例）。不 同部位（尿路与其他部位）选 择 药 物 不 完 全 相 同,（三）药敏试验结果表
6、示及临床意义,1.敏感（susceptible,S）是指当使用常规推荐剂量的抗菌药物进行治疗时，该抗菌药在患者感染部位通常所能达到的浓度可抑制该感染菌生长。 2.耐药(resistant,R)是指使用常规推荐剂量的抗菌药物进行治疗时，该抗菌药在患者感染部位达到的浓度不能抑制该感染菌生长；或者该药对该感染菌临床疗效尚未在以往治疗研究中可靠；或抑菌圈直径落在特定细菌发挥耐药机制的合适范围。,3.中介（intermediate,I) 中度敏感（moderately susceptible)，对于毒性低的药物可加大剂量（高于正常治疗浓度）给药，但是对毒性大的不能用。或者用于药物生理性浓集的感染部位如尿
7、。 缓冲区（buffer zone),防止因实验室技术因素造成的误差，特别是对安全范围窄的药物（治疗浓度接近中毒浓度）。重复试验。,4.剂量依赖敏感（susceptible-dose dependent,SDD)是指抗菌药对感染菌MIC接近该药在血液和组织中浓度，感染菌临床应答率可能低于敏感菌；若某药在高剂量使用时安全，则中介意味高剂量给药可能有效。主要用于真菌药敏试验。 5.不敏感新药问世，无耐药株，只有敏感折点，当MIC值高于敏感折点时，报告不敏感。,血药浓度与MIC之间的关系,（四）常用药敏试验方法 及其临床应用,常用药敏试验 纸片扩散法 最小抑菌浓度的测定法 E-试验法 抗菌药物联合药
8、敏试验,1.纸片扩散法(Disk difusion method) （定性） （1）方法：,（2）结果报告：敏感（S）或中介（I）、耐药（R） 根据： 参照美国CLSI/NCCLS制定的标准读取结果。 敏感限=breakpoints（分界点） 抑菌圈直径敏感限 S 耐药限 R 敏感限与 耐药限之间 I,肠杆菌科的抑菌圈直径解释标准和相对应的最低抑菌浓度（）值,（3）临床意义 根据患者病情选择“S”药物的种类不能选用“R” 药物“I”某些药物如-内酰胺类，加大药物剂量能达到治疗目的，或该药在感染部位浓度很高（尿液中喹诺酮类）。,2.最小抑菌浓度（minimum inhibitory concen
9、tration，MIC）的测定（定量） （1）方法：肉汤稀释法琼脂稀释法抗菌药物 倍比稀释琼脂平板, ,2g/ml,4g/ml,8g/ml,2,4,8,16,32,（2）结果报告：MIC值根据：CLSI 指南判断结果例如： 苯唑西林（MIC g/ml）S R金黄色葡萄球菌 2 4凝固酶阴性葡萄球菌0.25 0.5,（3）临床意义 根据病情选用不同种类MIC值小的 “S”药物,不能选用“R” 药物“I” 对某些药物如-内酰胺类，当加大药物剂量能达到治疗目的，或该药在感染部位浓度很高（尿液中喹诺酮类）时可选 。,3. E-test法 （1）E-test法是浓度梯度纸条扩散法, MIC测定（2）方法
10、：操作按纸片扩散法,（3）结果报告：同稀释法， MIC值（4）临床意义 “S” 、“R”、 “I” 药物的应用同前述 优点：各种细菌（苛养、非苛养、生长快的、慢的细菌）及厌氧菌、真菌的MIC测定。对重症感染病人选药治疗极为重要。,4. 抗菌药物联合药敏试验 （1）目的：是测定两种抗菌药物联合应用时的抗菌效果,（2）方法：纸片扩散法和稀释法,药物 B 稀释,药物 A稀释,（3）计算FIC指数： 部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration,FIC) FIC指数=A药联合MIC/ A药单测MIC+B药联合MIC/B药单测MIC结果 ： FIC指数 2 拮
11、抗,抗菌药物的PK/PD理论,抗菌药药效动力学参数 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration , MIC 最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration , MBC) 抗生素后效应(postantibiotic effect ，PAE) 亚抑菌浓度下的抗生素后效应(PA SME) 抗菌素后白细胞活性增强效应(Postantibiotic Leukocyte enhancement,PALE) 杀菌曲线(time-kill curves),（4）临床意义 （-内酰胺类+氨基糖苷类=协同） 提高疗效 减少药物毒性 减少耐药菌
12、发生。,二、细菌耐药主要机制,细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统 产生灭活抗菌药物的水解酶和钝化酶 细菌的抗菌药物作用靶位的改变 细菌膜外排泵系统 细菌生物膜的形成,l. 抑制细胞壁合成：环丝氨酸、万古霉素等；2. DNA促旋酶抑制剂：喹诺酮类； 3. RNA聚合酶抑制剂：利福平； 4. 50S蛋白质合成抑制剂：大环内酯类、氯霉素、林可霉素类； 5. 30S蛋白质合成抑制剂：四环类、大观霉素、氨基糖苷类； 6. tRNA合成抑制剂：Mupirocin； 7. 氯霉素酰基转移酶； 8. 抑制细胞膜合成：多粘菌素类； 9. 细胞周质空间：内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶； 10. 抑制叶酸代谢：磺胺
13、类。 THFA：四氢叶酸；DHFA：二氢叶酸。,细菌耐药性的机制,抗菌药物的作用靶位,多重耐药主动外排泵,三、常见耐药菌的耐药检测,耐药菌增加的原因,耐药菌产生增加（抗生素选择性压力）：由于医生过多地使用抗生素，造成对基因突变及耐药基因转移的耐药菌进行了筛选 耐药菌传播增加：通过医护人员尤其手的接触，细菌在病人间交叉寄生造成耐药菌株在医院内的传播，以及随后通过宿主病人的转移，耐药菌在医院间甚至社区进行传播,超级细菌？多重耐药菌,MRSA-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 VRE-耐万古霉素的肠球菌 ESBLs-产超广谱内酰胺酶 MDR-AB多重耐药鲍曼不动杆菌 MDR-PA-多重耐药铜绿假单胞菌 产N
14、DM-1细菌 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌,WHO对NDM-1的评估与建议,强化医务工作者和公众合理使用抗生素的相关政策 加强细菌耐药性监测 严格执行预防和控制措施，实施医院感染控制措施，控制多重耐药菌株的传播;,（二）细菌的耐药性监测方法,常见耐药细菌的 英文简称的含义：,MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRCoNS VRSA（耐万古霉素金黄色葡萄球菌） ESBLs (超广谱内酰胺酶) SSBLs（超超广谱内酰胺酶）= ESBLs+AmpC肠球菌低耐庆大霉素菌株，可内酰胺类联合氨基糖甙类治疗； 高耐庆大霉素菌株，可用万古霉素,一）细菌耐药表型的检测,1.-内酰胺酶的检测 -内酰胺酶试验采用色原法，挑取菌落涂在含有色原头孢菌素头孢硝噻吩的试纸片上，若试验菌产-内酰胺酶，则头孢硝噻吩被水解，纸片有黄色变成红色。-内酰胺酶试验阳性提示对青霉素酶不稳定的青霉素（如青霉素、氨苄西林等）耐药。常规需做-内酰胺酶试验菌株有葡萄球菌属、肠球菌属、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌以及其他革兰阴性厌氧菌。,超广谱-内酰胺酶的检测（ESBLs),由革兰阴性杆菌产生，质粒编码，其活性可被-内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制。ESBLs检测包括筛查试验和确证试验。ESBLs阳性提示该菌对青霉素类、头孢类和单环类抗生素耐药。常规检测ESBLs的细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形菌。,
