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1、核酸血液筛查,October 3, 2018,P1,目 录,P2,核酸血液筛查系统,October 3, 2018,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,PCR实验室的污染防治,分子生物学概论,P3,October 3, 2018,核酸的分子组成-核苷酸,分子生物学概论,P4,October 3, 2018,DNA的一级结构,Cytosine,Adenine,Thymine,Guanine,Hydrogen Bonds,Deoxyribose (Sugar molecule),Phosphoric Acid (Phosphate molecule),由A/T/G/C四种单核苷酸组成,分子生物学概
2、论,DNA的二级结构,P5,October 3, 2018,DNA分子由相互平行、走向相反、碱基互补的两条脱氧核糖核苷酸链围绕同一中心轴，盘绕成双螺旋结构，螺旋的一侧为大沟，另一侧为小沟。平行链对应碱基总是A=T、G = C配对（base pairing)或互补，形成稳定联系。,DNA双螺旋结构,P6,October 3, 2018,分子生物学概论,核酸的理化性质,DNA的热变性与复性,DNA热变性后缓慢冷却处理过程称退火 annealing DNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢键联系，两链维持分离状态。,分子生物学概论,P7,October 3, 2018,核
3、酸分子杂交 hybridization,当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对，出现复性现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链，称核酸分子杂交。,分子生物学概论,P8,October 3, 2018,DNA半保留复制,DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制(replication)。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(se
4、miconservative replication)。,核酸血液筛查相关技术,P9,October 3, 2018,核酸血液筛查相关技术,磁珠法提取核酸,荧光PCR技术与TMA技术,UNG-dUTP防污染系统,内对照分子,核酸血液筛查相关技术,P10,October 3, 2018,磁珠法提取核酸,样品核酸提取 磁珠法,核酸血液筛查相关技术,P11,October 3, 2018,磁珠法提取核酸,第一步：细胞的裂解：破碎细胞，并向溶液中加入磁珠。,第二步：结合核酸：pH较低，在高盐环境下，硅胶磁珠带正电荷，选择性的与优化试剂中的核酸结合,核酸血液筛查相关技术,P12,October 3, 2
5、018,磁珠法提取核酸,第三步：洗涤：用洗涤液将非核酸成分冲洗分离（为清洗干净该步骤可以重复多次）。,第四步：核酸的洗脱：pH升高，在低盐环境下，核酸被洗脱下来。,核酸血液筛查相关技术,P13,October 3, 2018,PCR技术,d.NTPs,耐热DNA聚合酶,引物,加入试管中,核酸血液筛查相关技术,P14,October 3, 2018,PCR技术,循环,循环,延伸,继续延伸,循环,核酸血液筛查相关技术,P15,October 3, 2018,PCR技术,第二个循环 4个拷贝,第三个循环 8个拷贝,第n个循环 2n个拷贝,核酸血液筛查相关技术,P16,October 3, 2018,
6、PCR技术,分子生物学概论,P17,October 3, 2018,TMA技术,核酸血液筛查相关技术,P18,October 3, 2018,TMA与PCR比较,核酸血液筛查相关技术,P19,October 3, 2018,荧光PCR技术,SYBR GREEN,Molecularbeacon,核酸血液筛查相关技术,P20,October 3, 2018,TaqMan荧光PCR技术,核酸血液筛查相关技术,P21,October 3, 2018,TaqMan荧光PCR技术,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and
7、 Sample,Denaturation,Annealing,Reaction Tube,l,核酸血液筛查相关技术,P22,October 3, 2018,TaqMan荧光PCR技术,Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. Polymerization Complete,4. Detection,l,核酸血液筛查相关技术,P23,October 3, 2018,荧光定量PCR技术,一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。,核酸血液筛查相关技术,P24,October 3
8、, 2018,CT值与阈值,CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。,核酸血液筛查相关技术,P25,October 3, 2018,CT值与阈值,实验操作中，CT值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的PCR循环次数（图）。“基线上方”也就是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是CT值。,核酸血液筛查相关技术,P26,October 3, 2018,荧光定量PCR检测流程图,核酸血液筛查相关技术,P27,October 3, 2018,UN
9、G-dUTP防污染系统,UNG：Uracil-DNA Glycosylase，也称为UDG，尿嘧啶糖基化酶,核酸血液筛查相关技术,P28,October 3, 2018,UNG生化特性,1,2,3,4,无作用： 游离U、A、 T、G、C和 RNA,不耐热： 37-50 95,分子量小球蛋白 发挥作用不依赖于Mg2+,作用范围： 单链和双链 U碱基 糖苷键,核酸血液筛查相关技术,P29,October 3, 2018,dUTP-UNG系统实施的必要性,产物污染 交叉污染 试剂污染 天然核酸的污染,实验室污染,物理分区 紫外线照射 高压消毒 10%次氯酸钠 DNase I消化 UNG消化,核酸血液
10、筛查相关技术,P30,October 3, 2018,dUTP-UNG作用原理,特异地识别DNA分子中尿嘧啶核苷,切割下来，形成自由的尿嘧啶和 “糖-磷酸”骨架,加热或碱性条件下， DNA在“糖-磷酸骨架”处断裂,模板无法扩增,dUTP代替dTTP扩增，形成UNG 有效作用底物U-DNA,核酸血液筛查相关技术,P31,October 3, 2018,dUTP-UNG作用示意图,核酸血液筛查相关技术,P32,October 3, 2018,dUTP-UNG优缺点,缺点,优点,Text,Text,防止含dU产物的污染 不影响目的片段的扩增 作用条件简单，易实现。,只防自身产物的污染，不防天然产物的
11、污染。 若混有核酸酶，会同时分解目的产物。 UNG致使CT值增加，易导致假阴性。 dUTP在对GC丰富的模板时作用不大。 灭活不够完全。 相对用dTTP，成本高。,VS,核酸血液筛查相关技术,P33,October 3, 2018,内对照分子,Text,Text,内参照的概念 人工合成的小片段DNA，放在反应液中和待测目的基因一起扩增。内对照是PCR方法检测疾病基因的必需成分，是防止假阴性、提高检测结果可靠性的重要标示。内对照对整个实验流程，包括样品提取、分装、PCR热循环仪孔间差、PCR抑制元素等等可能的影响因素进行监控，防止假阴性，提高安全性,核酸血液筛查相关技术,P34,October
12、3, 2018,竞争性内对照分子,3,5,5,3,3,5,1,20,291,310 (BP),两端为特异性引物,目的基因片段,内对照顺序,竞争性内对照的概念 与目的基因使用相同的引物。 扩增产物序列与目的基因不同，可用不同的探针检测。,核酸血液筛查相关技术,P35,October 3, 2018,竞争性内对照分子,3,5,5,3,3,5,1,20,291,310 (BP),内对照特异性引物,目的基因片段,内对照顺序,非竞争性内对照的概念 与目的基因使用不同的引物。 扩增产物序列与目的基因不同，可用不同的探针检测。,目的基因特异性引物,核酸血液筛查相关技术,P36,October 3, 2018
13、,内对照分子,内对照的作用真实反应扩增效率 避免假阴性：假阴性是目前血液筛查中最重视的问题之一，内标全程进行质量监控质控,血筛核酸检测的内对照设计理念 中心理念：监测全程的实验过程包含病毒核酸提取、反转录、及扩增过程的效率。 内对照选用：最好能达到上述三个条件，且能顾及仿真病毒的安全性。,核酸血液筛查系统,P37,October 3, 2018,核酸血液筛查系统,核酸检测样本汇集设备,自动化核酸提取设备,PCR扩增和扩增产物的检测设备,核酸血液筛查系统,P38,October 3, 2018,核酸血液筛查系统,分析后,采集容器 采集方式 保存运输 不合格样本： 脂血、溶血、样本量不足,样本,分
14、析中,分析前,检测结果,纯化试剂 准备,仪器 维护 自检,准备： 质控 样本 试剂,前处理 混样 信息录入,扩增检测,核酸纯化,检测系统,试剂 设备 质控品,检测试剂的准备,核酸血液筛查系统,P39,October 3, 2018,核酸检测样本汇集设备,加样器,HAMILTON 液体工作站,核酸血液筛查系统,P40,October 3, 2018,自动化核酸提取设备,自动化核酸提取(EZbead system-32),核酸血液筛查系统,P41,October 3, 2018,PCR扩增和扩增产物的检测设备,ABI7500实时荧光定量PCR仪,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,P42,Octo
15、ber 3, 2018,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,样本的采集,样本的运送,样本的接收与保存,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,P43,October 3, 2018,关注采集、保存、运输的细节,运输条件,离心,采血管,P44,October 3, 2018,标本的采集-采血管,无菌真空采血管 一、血清管普通血清管带分离胶的血清管 二、抗凝管EDTA 2K或3K抗凝管EDTA 2K抗凝间分离胶（PPT)枸橼酸钠抗凝管,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,P45,October 3, 2018,标本的采集-离心,离心条件800-1600g 20min 离心分离的时间要求HCV RNA
16、和HIV RNA 研究方式不同（样本、检测）结论差异大 离心时间 完成地点,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,P46,October 3, 2018,标本的运送,2-8C稳定48hr,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,P47,October 3, 2018,标本的接收、保存,确认标本数量 运输状态 标本状态：溶血、脂血 保存：用于检测的样本管：检测前保存用于留样备查的样本：样本量,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,P48,October 3, 2018,检测前核对,状态 标识 接收时间离心后至检测前2-8C保存不超过48小时,血站核酸检测样本的采集、运送和保存,P49,October 3, 2018,长期留样样本,理论上-80 C 保存量：核酸检测样本量比酶免确认实验大 长期保存：保存管密闭程度,
