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1、2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,第10章 基因工程基础,第一节 基因工程概述 第二节 目的基因的获得 第三节 分子克隆中常用的载体 第四节 分子克隆中常用的工具酶 第五节 目的基因和载体连接、转化、筛选 第六节 基因工程和医药,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,DNA克隆 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合. 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning), 即无性繁殖. 技术水平: DNA克隆:
2、分子克隆(molecular clone) 细胞克隆 个体克隆(动物或植物),第一节 基因工程概述,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,DNA克隆: 应用酶学的方法,在体外将各种来源的DNA(同 源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的)与载 体DNA接合成一具有自我复制能力的分子 复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主 细胞,筛选出含有目的基因的转化子,再进行 扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克 隆或重组DNA(recombinant DNA).,2018年10月3日4时34分,烟台
3、大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等,基因工程(genetic engineering) :实现基因克隆所用的方法及相关的工作,又称重组DNA工艺学. 目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质),2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,第二节 目的基因的获得
4、,一 目的基因的获得: 化学合成 聚合酶链式反应(PCR)方法扩增 建立基因组DNA文库 构建cDNA文库,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,化学合成法:要求:1)已知目的基因的序列或其产物的氨基酸序列 2)片段不宜太长工具:自动化DNA合成仪应用:1)合成PCR引物2)寡核苷酸探针3)人工接头序列及较小的基因,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,* 化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,2018年
5、10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,聚合酶链式反应(PCR)方法扩增,1985年美国科学家Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术 PCR是应用最广的分子生物学技术之一,可用来快速在体外扩增DNA, PCR技术在临床检验和分子生物学中的应用十分广泛. PCR技术就是在体外的离心管中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术,即体外进行DNA复制.,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai
6、University,需要的物质:模板DNA,引物,dNTP(Mg2+),TaqDNA聚合酶 4种反应混合物经历变性、退火、延伸三步94,热变性,双链解开55,冷却退火,引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合72,TaqDNA聚合酶作用下,新链延伸,形成互补DNA双链如此30个循环可获得230个基因片段,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,聚合酶链反应原理,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,Taq DNA聚合酶(
7、Taq DNA pol,Taq pol) 1969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真 菌,cetus公司首次分离纯化了该酶,分子量 94KD,该酶特点: 最适反应温度是75-80,能抵抗链分离所 需要的高温(94-95)的反复处理.,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University
8、,建立基因组DNA文库,基因组DNA文库:分离供体细胞中的染色体DNA,酶切后,将这些染色体 DNA片段与某种载体相接,而后转入大肠杆菌,建立包 含有供体染色体DNA片段的克隆株,特点:克隆株群体提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,构建基因组文库过程: 分离纯化基因组DNA 制备全部基因组的DNA片段机械断裂法(超声波或高速搅拌)断裂片段两端没有与克
9、隆载体匹配的粘末端, 因此插入载体之前还需要进行修饰加工,少用限制性内切酶降解(鸟枪法)(常用Sau3A)断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端,可以直接与处理过的载体连接 DNA片断与载体的连接常用载体:噬菌体 转化细菌 1个克隆含有基因组的某个片段,整个克隆群体就包 含基因组的全部基因片段总和.,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,构建cDNA文库,cDNA文库:以mRNA为模板在反转录
10、酶的作用下将形成的互补DNA(cDNA)建立基因文库. 特点: 无内含子,长度比基因组基因小,操作简单 mRNA比基因组中基因少,筛选基因工作量小 mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利于获得较多的模板. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同 不能研究基因组的结构功能,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,构建cDNA文库过程:1)制备mRNA. 先提取总RNA,再分离 mRNA.通过oligo(dT) 纤维素分离mRNA,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院
11、 School Pharmacy of Yantai University,2)第一股 cDNA合成 以Oligo(dT)为引物:从模板 3末端开始,沿模板35方 向合成 随机引物:以68个核苷酸 为随机引物,从mRNA的不同 结合点合成全长cDNA第一链 3)第二股cDNA的合成自身引导法外加引物合成法,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,4)cDNA与载体连接和导入宿主细胞,2018年
12、10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,第三节 分子克隆中常用的载体,载体：为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达所采用的一些DNA分子. 基本特征: 能自我复制、有多克隆位点、有选择标记 常用载体有3大类:1.质粒2.噬菌体3.病毒,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,根据使用目的分为： 克隆载体：使插入的外源DNA序列扩增 表达载体：使插入的外源DNA序列转录翻译成多肽链,理想的质粒载体,应具备以下几个条件 (1)能自主复制,即本身是复
13、制子 (2)具有一种或多种限制酶的单一切割位点,并在此位点中插入外源基因片段,不影响本身的复制功能 (3)在基因组中有1-2个筛选标记,为寄主细胞提供易于检测的表型特征, (4)分子量要小,多拷贝,易于操作.,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,一 质粒载体,1.质粒的基本特性 本质是细菌染色体以外的遗传物质,是一种简单的,能自主复制的环状DNA分子. 命名:前一个小写p代表质粒,后两个大写英文字母代表发现者或实验室,数字代表编号,如pBR322,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School
14、Pharmacy of Yantai University,质粒的复制类型:严紧型:低拷贝 1-3个拷贝/菌 松弛型:高拷贝 10-60个拷贝/菌不相容性:在同一细胞中,同类质粒不能并存的现象.pUC18 pUC19分配功能:质粒复制后,随细胞分裂的进行,质粒分配到子细胞中,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,2.质粒的分离纯化方法,氯化铯-溴乙锭密度梯度超速离心分离法 Triton和PEG化学提取法 煮沸裂解菌体,异丙醇沉淀质粒DNA 碱变性法抽提质粒DNA 试剂盒法,2018年10月3日4时34分,烟台大
15、学药学院 School Pharmacy of Yantai University,1、接大肠杆菌于4ml LB培养基 2、37振荡培养过夜 3、取1.5ml菌液于Ep管,5000rpm离心3min,弃上清 4、加0.lml溶液I(1葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0, 25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1 SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 7、10000rpm离心15min,取上清液于另一新
16、Ep管 8、加入等体积的异戊醇,混匀后于静置10min 9、再以10000rpm离心5min,弃上清 10、用70乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体 11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中,2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,3.大肠杆菌质粒载体,1) pSC101质粒载体第一个克隆真核基 因的载体(非洲爪蟾卵母细胞rDNA),2018年10月3日4时34分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,Ampr,ORI,Tetr,2)pBR322质粒:一种克隆质粒,ORI:复制起始点, 保证高拷贝自我复制.,结构:,Ampr, Tetr:,两个抗性基因用于 筛选阳性克隆.,Pst I, BamH I:,
