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1、细胞培养的基本知识、 基本技术,主要内容：,1、细胞培养基本知识 2、培养细胞生长的条件 3、细胞培养的基本技术,一、 细胞培养,把取得的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。,培养细胞的特性1 -生长方式及类型,贴附型、悬浮型,培养细胞的特性2 - 增殖特点,体外培养的细胞既保持了一定的体内细胞的基本特性，但也具有本身的一些特点。贴附-伸展 接触抑制-增殖的密度抑制,贴附-伸展,接触抑制,当一个细胞被其他细胞围绕导致无处可去而保持接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜活动将停止。 因此，一般正常细胞并不相
2、互重叠于其上生长。,细胞增殖密度抑制,当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在静止状态下维持存活一段时间，但不会继续分裂生殖。转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至较高的终末细胞密度。,培养细胞的特性3 -生长过程,单个细胞增殖：细胞周期,高等生物体，细胞周期时间的长短变化主要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳定。Hela 8-16h 5-9h 2-8h 20-28h,一群细胞的增殖：细胞生长曲线,接种后，每天进行检测计数，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标，绘制成曲线。 测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判
3、定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。饱和密度：在特定条件下，培养器皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖。,潜伏期/滞留期 指数增长期 平台期/停滞期 退化或死亡,细胞系的生长过程 细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。 细胞株：通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。 细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系,有限细胞系：如果不能继续传代或传代有限，可称为有限细胞系。 连续细胞系：能够连续传代的细胞叫做“连续细胞系或无限细胞系。可培养50代
4、以上并无限培养下去。大多数的二倍体细胞为有限细胞系。无限细胞系大多已发生变异。,原代细胞：从机体取得组织材料，在体外培养生长，到第一次传代前。传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。,培养瓶培养法,方法：将培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。,优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作，以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。,培养板培养法,方法：将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。应培养量较小也称为微量培养。,悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早建立的体外培养技术,
5、基本要点：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中培养。,1907 年 -Harrison用细胞培养解决一个难题盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法,悬滴培养法基本步骤,1、在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆和植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。,2、在凹载片周围涂凡士林。将凹载片向下压向盖玻片,3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。放入培养箱培养,1910 至 1923年 Carrel 和早期的组织培养卡氏瓶培养法,1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞
6、系。1951年Gey首建人肿瘤细胞Hela细胞系。从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。,无血清培养,无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。 观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。 往往针对性很强，价格偏高。,三维细胞培养技术,将具有三维结构
7、不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长, 构成三维的细胞-载体复合物。,普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行, 但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。应用： 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）,目前常用的三维
8、培养模型：基质覆盖培养旋转烧瓶培养微载体培养预置支架培养旋转细胞培养系统自发性细胞聚集,细胞培养技术的特点及应用,优点： 1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体内的细胞。,应用,病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体 遗传学：染色体分析 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变 细胞毒实验：药效测试 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿,营养需要,环 境 要 求,无毒及无污染,二、培养细胞生长的
9、条件,1 、细胞的营养需求,（1）氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子 （2）促生长因子等完全培养基的组成：基础培养基 80一95血清 5一20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100单位毫升,基础培养基的选择,参考： (1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM
10、-高糖（标准型）、 DMEM-低糖（标准型）、DMEM-F12 等,血清,热灭活：56, 30 分钟加热已完全解冻的血清(目前少用） 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。热处理造成血清沉淀物增多，影响血清质量。甚至严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。 血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此
11、小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清,血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清：胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。,pH 调整液,NaHCO3 溶液（碱） 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存 HEPES（分子量238.31）溶液 一种弱酸，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以
12、维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L,抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。最终使用浓度为每毫升100单位。,制备1000ml RPMI 1640培养基,RPMI 1640 干粉培养基10.4g（1包） 超纯水 400ml 磁力搅拌至完全溶解 加超纯水定容至1000ml 在超净
13、台内无菌条件下，用灭菌后的并置有 0.22m 孔径滤膜的过滤器除菌，分装200ml/瓶，-20保存备用。用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。,消化液,分离组织和分散细胞 常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 单独或混合使用,胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Ha
14、nks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液（常用浓度为0.25% ）搅拌混匀，置室温 4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20保存备用（以免分解失效）， 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调 pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,EDTA4Na 溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长,D-Hanks 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solut
15、ions, D-HBSS),2、 环境要求,细胞培养必须具备细胞生存并繁殖的生理学能接受限度内的物理化学特性 （1）温度 （2）气相 （3） PH,温度,体外培养的细胞需要在保持一定恒温的环境中才能生长。在达到最适温度（37）前，一般细胞繁殖率因温度的升高而增加，但是，温度逐步升高并超过最适温度时，繁殖会被抑制。 当温度在25- 35，细胞的生长速度很慢，但能够生存；细胞在4也能存活数天；只要温度不低于0，细胞都能生存；加了保护剂还能放到液氮中保存。 当高温时，在41- 42中培养1h，细胞损伤严重，43以上，则多数细胞死亡。 高温比低温对细胞的影响更为明显。,气相和PH,5% CO2 + 9
16、5%空气混合气体（O2）。 CO2既是细胞生长所需，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的PH有关。 最适PH 7.2 7.4 低于PH 6.8或高于PH7.6可能对细胞有害，甚至死亡。,酚红指示剂：黄 6.6 橙 8.0 红,3、无毒无污染,无 毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。若具细胞毒性，细胞容易导致死亡。因此，选用器皿和材 料时必须注意。,体外培养的细胞缺乏机体免疫系统，无防御能力，一旦发生细菌等污染，细胞最终会死亡。 交叉污染容易使细胞系失去原有特性。,三、细胞培养基本技术,1、原代细胞培养 2、传代细胞培养 3、培养细胞生长状况的观察 4、细胞冻存、复苏、运输,
