第十三章生物制品

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1、10:07:50,第 十 三 章,生物制品分析概论,10:07:50,第一节 概 述,三大主要药物,化学药物,生物药物,中 药,10:07:50,10:07:50,一、生物药物与生物制品,1. 生物药物,一般是指从动物、植物及微生物提取的，也可用生物化学半合成或用现代生物技术制得得生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子得结构修饰物等。,包括：氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、脂质、核苷酸类等,10:07:50,发展过程,第一代：利用生物材料加工制成,第二代：根据生物化学和免疫学原理，应用近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成份,第三代：应用生物工程技术生产的天然生理活性物

2、质,鱼肝油,胰岛素,重组 人生长激素,10:07:50,生物药物,生化药物,生物合成药物,生物制品,从生物体内分离纯化制得得升华基本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得得一类药物。,利用现代生物技术研制得药物，其中用基因工程生产得药物称基因工程药物。,应用普通得或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源得组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病治疗、预防和诊断得药品。,来源和 生产方法,10:07:50,动植物及微生物提取、分离的天然生物活性物质及半合成得到生命基本物质及其衍生物等,2. 生化药物biochemical drugs,人纤维蛋白原,

3、凝血酶、胰蛋白酶,肝素、玻璃酸,氨基酸、Pr类,酶、辅酶类,多糖类,脂类,核酸类,10:07:50,应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的药品,自动免疫制品,3. 生物制品biological products,其他（血液制品、组织制品等）,免疫血清,菌苗、疫苗、类毒素,诊断制品,10:07:50,基因工程药物,激素类及神经递质 类药物,细胞因子类药物,酶类及凝血因子类药物,人生长激素释放抑制因子 人胰岛素 人生长激素,人干扰素 人白细胞介素 集落刺激因子,10:07:50,重组胰岛素原的合成,10:07:

4、50,4. 生化药物和基因工程药物特点 1）共同特点：活性强，毒副作用小 2）分子量大，结构确证难 3）全过程的质量控制：从原料、菌种到生产设备、中间体、产品 4）生物活性检查 5）安全性检查：异常毒性检查、过敏物质检查、外源性DNA残留量、宿主菌蛋白残留量等 6）效价（含量）测定,10:07:50,二、生物制品的种类和特点,（一）生物制品的种类1、疫苗类药物（vaccines）用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚、或经组织培养后制成。,10:07:50,疫苗类药物种类（1）细菌类疫苗：卡介苗、狂犬病疫苗等 （2）病毒类疫苗：乙肝疫苗、腮腺炎减毒活疫苗 （3）联合疫苗：麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗 （

5、4）双价疫苗及多价疫苗,10:07:50,2、抗毒素及抗血清类药物（antitoxin and antisera）（1）抗毒素：用细菌类毒素或毒素免疫马等大动物所取得的免疫血清。（白喉抗毒素）（2）抗血清：用细菌或病毒免疫马等大动物所取得的免疫血清。（抗狂犬病血清）,10:07:50,3、血液制品（blood products）由健康人的血液或经特异免疫的人血浆 经分离、提纯或重组DNA技术制成的血浆蛋 白组分，及血液细胞有型成分。人血白蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白,10:07:50,4、重组DNA制品（recombinant DNA products）利用重组DNA技术，将遗传修饰的编码DNA

6、通过质粒或病毒载体导入受体细胞、微生物，DNA在细胞中不断复制、表达，产生蛋白质(药物)。,10:07:50,重组DNA制品种类： 1、细胞因子：重组人干扰素、白介素 2、生长因子：重组人表皮生长因子 3、激素：重组人胰岛素 4、酶：重组链激酶 5、疫苗：重组乙型肝炎疫苗（酵母） 6、单克隆抗体：抗人T细胞CD3鼠单抗,10:07:50,5、诊断制品（diagnostic reagents）用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫状态的制品,10:07:50,诊断制品的种类： 1、体外诊断制品：由特定抗原、抗体或有关生物物质制成的免疫诊断试剂、试剂盒。（HBsAg酶联免疫诊断试剂盒）2、体内诊断制品

7、：有变态反应原或有关抗原材料制成的免疫诊断试剂。（结核菌素纯蛋白衍生物）,10:07:50,6、其他由有关生物材料或特定方法制成的生物制剂。胰岛素、胃蛋白酶,10:07:50,（二）生物制品的特点,10:07:50,生化药物即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。 例如： 1、低分子量肝素，其抗凝活性低于肝素。2、胶原蛋白的保湿功能远大于胶原多肽。,10:07:50,不同质控方法检测对象的特点,10:07:50,三、生物制品的全程质量控制,、来源与种类 、纯度 、性状 、干燥失重或水分 、鉴别 、残渣 、氨基酸组分分析 、生物活性 、肽图 、热原试验 、糖含量 、含量分析,10:

8、07:50,(一)生物制品质量控制重点,1、有效成分的同一性、结构确证 2、有效成分的均一性、纯度检验 3、有害物质及残余杂质的控制 4、高效灵敏的生物活性测定方法,10:07:50,收录于中国药典和中国生物制品规程,鉴别,杂质检查,安全性检查,含量（效价）测定,10:07:50,1.鉴别,1）理化鉴别法：UV、肽图等,反应序列信息,RP-HPLC法分析重组人胰高血糖素类多肽1（736）肽图谱,rhGLP-1(7-36)由30个氨基酸组成，结构中含2Lys、1Arg、1Asp、3Glu,10:07:50,2）生化鉴别法：免疫法、酶法、电泳法等,3）生物鉴别法：动物试验等,专属性强，应用广泛,免

9、疫双扩散法,10:07:50,2. 杂质检查,1）一般杂质：氯化物、重金属、水分等 2）特殊杂质：有关物质等,高效凝胶过滤色谱法(High Performance Gel Filter ，HPGFC）、RP-HPLC,萄聚糖凝胶 立体网状结构图,10:07:50,标准蛋白色谱图,1.右旋糖酐蓝 2.醛缩酶 3.血清白蛋白 4.碳酸酐酶 5.抑蛋白酶肽 6.酪氨酸,10:07:50,3. 安全性检查,1）热原检查 家兔法、鲎试剂法 2）降压物质检查 3）过敏试验 4）异常毒性试验 豚鼠、大鼠存活试验 5）无菌试验 6）宿主细胞蛋白残留、DNA残留 ELISA法,10:07:50,1）理化分析法：

10、重量法、滴定法、 电化学法、光谱法色谱法（HPLC法）,4. 含量（效价）测定,例：蛋白质含量测定（ChP2005三部）凯氏定氮法Lowry法双缩脲法,10:07:50,2）生化分析法酶法：免疫分析法,酶活力测定法 以酶为分析对象进行分析 酶分析法 以酶为分析工具或分析试剂的分析方法,10:07:50,3）生物检定法药物对生物体或离体器官所起的生物活性,测定效价时采用参考品，体内、体外方法测定活性，计算效价IU同时测定蛋白含量，计算特异比（比活性，IU/mg）,10:07:50,第二节 鉴别试验,一、理化鉴别法（一）化学鉴别法：呈色反应，沉淀反应鱼精蛋白（-CONH-）结构有双缩尿反应。胃蛋白

11、酶 + 酸、碱、有机溶剂、重金属肽链破坏 沉淀,10:07:50,（二）紫外分光光度法辅酶A 的结构中含腺嘌呤，有紫外吸收。蛋白质、多肽有固定的最大吸收波长。,10:07:50,3、HPLC法保留时间、肽图的一致性（纯度95%以上）。构型均一，一个峰；构型不同，会出现两个峰。,10:07:50,二、生化鉴别 （一）酶法尿激酶（蛋白水解酶） 激活牛纤维蛋白溶酶原溶解纤维蛋白 产生气泡,10:07:50,（二）电泳法肝素（水溶液带负电荷）采用琼脂糖凝胶电泳法鉴别，与对照品一致。,10:07:50,（三）生物芯片技术 人类基因组计划的实施和大量珍贵的功能基因组数据的获得，使得蛋白质研究显得越发重要。

12、 蛋白质芯片技术的出现为我们提供了一种比传统的凝胶电泳法更为方便和快速的研究方法。,10:07:50,生物芯片技术是一种将生命科学研究中的许多分析检测步骤和装置通过并行化和微型化处理后集成在一个只有几平方厘米大小的载体上的分析检测系统。,10:07:50,在薄片载体上有规则地放置成千上万甚至几十万个特性各异的生物单元（如DNA、蛋白质或生物组织；相应地被称作为基因芯片、蛋白芯片或组织芯片）；,10:07:50,然后将其与待测样品在一定条件下反应，根据荧光等信号的变化来实现对未知样品的检测。,10:07:50,10:07:50,三、生物鉴别 （一）血清学法体外抗原抗体试验1、凝集反应 5、免疫扩

13、散2、沉淀反应 6、免疫电泳3、中和反应 7、荧光标记4、补给反应 8、酶标记,10:07:50,（二）生物学法家兔惊厥试验鉴别胰岛素：胰岛素大剂量注射 家兔血糖降低30% 惊厥注射50%葡萄糖 惊厥停止,10:07:50,第三节 杂质检查,一、一般杂质检查氯化物、硫酸盐、重金属、酸度、溶液澄清度、水分、干燥失重、残渣等。检查方法与化学药物相同。,10:07:50,二、 特殊杂质检查,特殊杂质的种类：1、生物污染物：微生物、宿主细胞蛋白、外源DNA 2、产品相关杂质：二聚体、多聚体、突变物、脱氨氧化产物等 3、工艺添加剂：残余抗生素、蛋白分离剂、防腐剂等,10:07:50,（一）宿主细胞蛋白残

14、留量检查采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定,一般，病毒侵入的细胞就叫宿主细胞。病毒一般没有成型的细胞核，一般被蛋白质所包裹在里面的是它的遗传物质，在病毒获得宿主后，利用宿主的蛋白质和其他物质制造自己的身体，然后将遗传物质注入到细胞内部感染细胞，有的使细胞死亡，有的会使细胞变异，也就是所谓的癌变。,10:07:50,残留在生物制品中的宿主细胞蛋白(Host cell protein, HCP)属异源蛋白,既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞(传代细胞)分泌的促生长因子。 有研究报道,HCP不仅能引起机体的过敏反应还有可能引起机体对蛋白质药物产生抗体。 建立HCP残留量的检测手段对加强生物制品

15、工艺过程的质量监控并最终提高制品的质量有极大的帮助,同时有助于开展药品生产的规范化研究,切实降低临床使用药品不良反应事件的发生。,10:07:50,（二）外源性DNA残留量检查（1）分子杂交技术(hybridization） （2）DNA结合蛋白（threshold）分析系统 （3）实时定量PCR (Q-PCR),10:07:50,（三）产品相关杂质的检查 1、重组人生长激素产品中有关物质的限量检查 （1）相关蛋白质 （2）高分子蛋白质 2、破伤风抗毒素中痕量蛋质的检查 （四）残余抗菌素生素的检查,10:07:50,二、安全性检查,（一）无菌检查 （二）热原检查 家兔法检查热原 （三）细菌内毒素检查：家兔法、鲎试验 （四）异常毒性检查与特异性毒性检查：观察一定剂量药物的急性毒性反应。 （五）过敏试验：检查异源蛋白 （六）致突变试验 （七）生殖毒性试验,10:07:50,异常毒性检查和特异性毒性检查：限度试验（1） 异常毒性检查：通用安全试验，检查是否污染外源 性毒性物质。（2） 特异性毒性检查：检查某些疫苗是否存在自身毒素引起的特异性毒性的不安全因素。,10:07:50,（1）异常毒性检查 例：小鼠（17 22g）5只 腹腔注射供试品0.5ml 观察7天 每只小鼠体重增加不得死亡 如有一只死亡 重复试验,