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1、第四章 常用临床生物化学检验技术,临床生化检验教研室 李 艳,常用临床生物化学检验技术,光谱分析技术: 最基本和最常用 电化学分析技术 电泳分析技术 层析和离心分析技术 自动化分析技术,教学目的和要求,掌握：分光光度技术的基本原理及定性和定量方法 自动生化分析仪的工作原理及参数设置熟悉: 分光光度计的的基本结构操作方法光源检查和波长校正离心机相对离心力公式 了解：离心机、自动生化分析仪的类型原子分光光度计的类型其他光谱分析技术的基本原理及应用,第一节 光谱分析技术,光谱分析技术指利用物质具有吸收 光谱特点 发射 对物质进行定性散射 定量,分析方法。,定义：利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散
2、射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。,一、光谱分析分类,发射光谱: 火焰光度法原子发射光谱法荧光光谱法； 吸收光谱: 紫外分光光度法可见光分光光度法原子吸收分光光度法红外光谱法； 散射光谱: 比浊法,光波于两个波峰或波谷之间的距离称为波长，其单位用纳米（nm）来表示。1nm=10-9m。,波长 11000m 射频区 波长 0.1100cm 微波 波长 7601000nm 远红外射线 波长 400760nm 可见光 波长 200400nm 紫外光 波长 10200nm 远紫外光 波长 10-10nm x射线 波长 510-30.14nm 射线,二、波长与颜色,不同
3、波长光线的颜色光的波长（nm） 颜 色 光的波长（nm） 颜 色 620 760 红 色 480 500 青 色 590 620 橙 色 430 480 蓝 色 560 590 黄 色 400 430 紫 色 500 560 绿 色,三、互补色,把任意两种能合成白光的单色光，称为互光(或互补色)。,四、物质颜色与光的关系,溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点选择性地吸收某种颜色的光所引起的。 某溶液对各种颜色的透过程度相同，无色透明； 如对各种波长的光完全吸收,呈现黑色 如对各种波长光完全反射,呈灰色 若只让一部分波长的光透过，即溶液呈现是与它吸收的光完全互补的颜色。 硫酸铜溶液因吸收黄色，
4、而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸收绿色，而呈紫色。,紫外-可见分光光度计 紫外分光光度计的波长范围： 190nm400nm 可见分光光度计的波长范围： 400nm800nm 紫外-可见分光光度计的波长范围：200nm1000nm,任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的。,Lambert- Beer定律,当液层厚度不变时，溶液吸光度与溶液浓度成正比，称为Beer定律。,利用溶液颜色的深浅来测定溶液中物质含量的方法，称比色法。,A =KCL,A为吸光度；K吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C 为溶液浓度。,光谱分析仪器的基本构造,紫外-可见分光光度计,721分光光度计,第三节计算方法,（一）
5、计算公式,在标准溶液中：AsKsCsLs 在待测溶液中；AuKuCuLu,将两式相除可得：,摩尔吸光系数(),根据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数(),是特定波长下的吸光度值。 的意义是：是物质的特征性常数。在固定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。,摩尔消光系数方法,值与入射光波长、溶液的性质等因素有关 如NADH在260nm时，为15000在340nm时， 为6220,2比较法(对比法),每次随同测定管制备一个标准管， 用已知浓度的标准液与待测液经相同条件处理，分别测定“标准管（
6、S）”和“待测管（U）”的吸光度As和Au，按下式计算待测物浓度：,使用标准比较法必须遵守的条件,必须严格遵守朗伯-比尔定律即吸光度与浓度成正比每次测定时需要作标准管，二者同时操作所处环境的变化完全相同，误差就可以相互抵消。 标准与测定的浓度愈接近，误差就愈小。 缺点 每次需要作标准管，繁琐，浪费试剂。 结果需要计算，手续麻烦。 标准管与测定管浓度不能相差太大。,A,计算：,2标准曲线法,根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。 配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标
7、,适用 反应结果比较恒定标准溶液不易保存的情况下,方法 一般至少选5个等间距浓度。 浓度范围在样品待测物浓度的l/22倍之间， 吸光度范围在0.051.0之间较为合适。 按规定条件与样品作同样处理，在特定波长(一般选择max)下测定它们的吸光度。 横坐标表示标准液浓度，纵坐标表示吸光度，若符合Beer定律，则各对应点可连成一直线并通过原点。如此绘出的曲线称为标准曲线,在测得待测样品的吸光度后即可在标准曲线上查出待测物浓度。,注意事项,标准曲线不宜长期应用 试剂纯度应足够高，溶液浓度应配制准确； 应重复测定35次，每次设置平行管，以保证良好的重复性； 坐标比例应适当选择，使绘出的直线与横坐标的夹
8、角在45o左右。 标准曲线分类 标准曲线的拟合法可分为目测法和计算法两种。,标准曲线制备,比例的选择 最好是方块的即长与宽相等或纵：横=2:3。 一般是2525cm2或用纵:横=2:3，如2030cm2比例坐标纸， 浓度全距占多少格，A的全距也应占多少格 空白A等于0，则绘出的曲线通过原点，成45o角的直线，若曲线大于或小于45o都不能准确,样品浓度的选择,一般包括待测样品的可能变异的最高值与最低值。例如血LDH比色法测定，正常波动范围在190437金氏单位，疾病时可能低至190金氏单位，高至750金氏单位，所以标准曲线浓度应从1251000金氏单位 一般原则是5种不同浓度，要求较高的一般选择
9、67种。 浓度差距一般是等距或浓度差距相似，但应同时考虑样品浓度较集中的一段，差距可以小一些，如LDH可选择125、250、500、750、1000金氏单位。,选点,例如金氏法测血LDH试 管 B 1 2 3 4 5 金氏单位 0 125 250 500 750 1000 吸光度（A） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 首先，确定浓度位置，因浓度一般是成倍增加，或者等级增加，容易确定。假设横轴（x）有效长度采用250格(25小格)则其位置为：,金氏单位 0 125 250 500 750 1000 横坐标位置 0 50格 100格 150格 200格 250格那么纵坐标的有效长度也应
10、取250格，可以先把最高吸光度（A）定出位置。A 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0纵坐标位置 (格) 250 200 150 100 50 0也可由以下两种方法确定：一种是求出1格相当于多少A,去除以欲确定的A0.5/250 = 0.002 1格相当于0.002A0.4/0.002 = 200格,另一种是求出0.01A相当多少格,去乘以欲确定位置的A，0.5:250 = 0.01:x即0.01相当于5格。 ( 0.3/0.01 )5 = 150格0.3A相当于150格 浓度位置向右延伸,A位置向上延长，交点即为此座标点 若不能连成一条直线，有两个处理原则： 通过原点，尽可能使直线通过
11、更多的点, 若有两点不在一条直线上，则使直线从两点中间通过，不应使两点位于线段的一边,(6)标准曲线分类,分为目测法和计算法两种。 直视法 计算法 标准曲线为直线时，直线回归方程式表示：直线回归分析是找出描述两个变量间关系的直线方程，以确定一条最接近于各点的直线，使各点与该直线纵向距离平方和为最小。这种方程式为直线回归方程，这条直线为回归直线。,x为溶液中物质单位; Y为推算吸光度估计值，是个变量； a是截距； b是回归系数，即斜率。 当x变动一个单位时，平均变动b个 单位，所以工作曲线的灵敏度由b决定。,直线回归分析的任务是找出描述两个变量间关系的直线方程，以确定一条最接近于各点的直线，使各
12、点与该直线纵向距离平方和为最小。这种方程式为直线回归方程，这条直线为回归直线。,回归方程所代表的直线在坐标平面上画出来，只须知道两点坐标就行。 这两点不宜离得太近，一般取一最小值和最大值的两点，将这两点连接成一直线，其余各点均散布在两旁 标准曲线适用的范围应只限于x值的实测范围以内，当测得待测样品的吸光度后，便可很快从此曲线查出其浓度值(图3-6)。,公式及计算,只要算出斜率b和截距a即可求得直线回归方程,例如 赖氏法制备血清ALT标准曲线 。,X为ALT单位,Y为吸光度,a=0.021表示空白读数。 b=0.00081表示本法的灵敏度。 即ALT变化一个单位时，吸光度A变化0.00081,例
13、题测得未知血清中ALT的吸光度为0.050，根据回归方程式计算得：,此标本血清ALT为35.8单位，也可从回归曲线上查找。,绘制回归曲线：选择两点，一般选择相距较远而在坐标纸上容易找到的两个点，如： 连接两点（100，0.102），(500，0.426)的一条直线即为回归线，此线向下延伸与Y轴相交一点，此点到原点之间的距离为截距a.,若测得一个未知血清ALT的A为0.3，求出ALT的浓度。,或在标准曲线求出ALT为344.4单位。,3因数法,先配制出一系列浓度不同的标准溶液，分别测定其A，然后各自以其A除以浓度，得出单位浓度下的吸光度值。 测定条件不变时，此数是个常数(实际上就是吸收系数，但没有严格的条件要求，其数值还不能作为定性分析依据)；用K表示。然后求出K的平均值，此数的倒数值就是欲求的“计算因数”。被测试样的吸光度值一旦测得，乘上这个因数，得出试样的测定结果。,例：用双缩脲法测定血清蛋白质，先配制成已知浓度的蛋白质标准溶液：2g/dl，4g/dl, 6g/dl，8g/dl，10g/dl五种浓度。按该方法的测定程序，分别测出它们的吸光度，计算出因数值。 双缩脲法测定血清蛋白质蛋白质标准液浓度 （g/L） 2 0.054 0.02704 0.108 0.02706 0.159 0.02658 0.214 0.026710 0.267 0.0267,
