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1、生物技术药物的药代动力学特点及检测,广州蓝韵医药研究有限公司 专注于中药新药临床前研究，保健品研发,Cumulative Revenues of Selected Biotechnology Companies (Amgen, Genentech, Chiron, Genzyme and Biogen),Selected Blockbuster Protein Pharmaceuticals,生物技术药物,重组蛋白多肽类 单克隆抗体及其片断 寡核苷酸 疫苗制剂 基因治疗药物（核酸制剂） 干细胞药物？,蛋白肽类药物药代动力学,吸收 分布 代谢与排泄,蛋白肽类药物吸收,小分子多肽：被动吸收 大分子
2、多肽： 水溶性：细胞间隙 脂溶性：膜脂扩散 胞饮 淋巴系统吸收：po干扰素；高度脂溶性？ 影响蛋白肽类药物吸收因素 药物稳定性； 细胞渗透性：MW1000，鼻粘膜肠粘膜,Correlation between MW and the cumulative recovery of sc rINF alpha-2a, cytochrome c, inulin and 5-fluoro-2 -deoxyuridine (FUDR) in the efferent lymph in sheep,蛋白肽类药物吸收,非肠道给药( Parenteral Route)：IVMSCIP鼻腔肺直肠回肠阴道颊口服 鼻
3、腔给药(Intranasal administration); Inhale administration; 口服给药(Oral administration ) Peroral administration 经皮给药(Transdermal administration); 其他给药途径: 结肠、回肠、子宫、阴道、颊、眼睛等。,IM 和SC给药生物利用度,Pharmacokinetics of IM ADI-SS PEG 20,000 mw in humans with hepatocellular carcinoma,Intranasal administration,易给药；鼻粘膜上皮细
4、胞有大量的微绒毛和广泛分布的血管淋巴管；无肝首过效应； 伪首过效应(Pseudofirstpass effect)；多肽、蛋白酶（主要是氨肽酶）； calcitonin, oxytoxin, LH-RH, growth hormone, interferone, vaccines； 分子量up to 2 KDa: pharmacologically acitive； 血脑屏障：IGF-1。,Inhalation administration,Ease of administration large surface area (75 m2) High vascularity Bypass of
5、first-pass metabolism Insulin for Type II diabetes Dornase-alpha for cyctic fibrosis,Proteases in the lung Local effects Effect of molecular weight?,Plasma bioavailability of therapeutic peptides versus MW after pulmonary administration,Oral administration,Generally not therapeutically active; Facto
6、rs for lack of systemic bioavailability: high gastrointestinal enzyme activity gastrointestinal mucosa as an absorption barrier; cytochrome P450 3A and p-glycoprotein activity Available oral forms: cyclosporine (30%) and desmopressin (0.16%); Absorption enhancers; encapsulation in microparticles or
7、nanoparticles.,蛋白肽类药物的分布,分布容积小：0.04-0.2 L/kg vs. 1-20 L/kg(小分子); 分子量大; 水溶性大; 蛋白结合率高？ 中央室（Vc):3-8 L=plasma volume和平衡室(Vss):14-20 L2x中央室; 蛋白结合: reduce clearance; Site-specific and target-oriented receptor mediated uptake,蛋白肽类药物分布：血脑屏障,血脑屏障： 缺乏特异转运系统； 存在蛋白分解酶； 外排作用泵 提高血脑屏障对蛋白多肽类药物摄取的方法： 脂质体 鼻腔给药； 脊髓管灌注
8、或泵连续输注。,Ziconotide cerebrospinal CSF concentration as a function of time,CSF Ziconotide Pharmacokinetic Results by Dose Group,小分子药物代谢,Drug biotransformation is divided into two types of reactions: phase I (hydrolysis, oxidation, and reduction) phase II reactions: conjugation (uridine diphosphoglucur
9、onosyl transferase (UGT), N-acetyl transferase (NAT), glutathione S-transferase (GST), and sulfotransferase (ST).,小分子药物代谢,蛋白肽类药物代谢与排泄（消除：elimination),蛋白水解酶（溶酶体、蛋白酶、组织蛋白酶、氨肽酶、二肽酶）: throughout body Proteoses Peptisases 受体介导清除(receptor-mediated endocytosis): t-PAliverlow density lipoprotein receptor-ma
10、nnose-asialogglycoprotein receptor; insulin 蛋白水解酶稳定：环孢菌素P450?,蛋白肽类药物代谢与排泄,肾脏 肾小球：30 Kd, eg.,IFN, IL-2, 肾小管 近曲小管(proximal tubule) endocytic vesicle hydrolysis into peptide fragments: IL-2, IL-11, growth hormone, insulin Luminal membranes: hydrolysis: small linear peptides: ANGI, ANGII, bradykinin, gl
11、ucagon, LH-RH Endocytosed and degraded in lysozymes: larger and more complex proteins peptides Peritubular capillaries: growth hormone 肝脏: insulin, glucagon, epidermal growth factor, antibodies, and t-PA 胆道: 血液: endo-oligopeptidase? 肠道,蛋白肽类药物特点及其应用,明显的种族特异性：实验动物的选择； 免疫原性：ELISA; 反复给药产生抗被测试药物的抗体； 体内有大
12、量的蛋白肽类物质包括结合蛋白：生物样品的前处理：LC-MS； 被测试药物尤其细胞因子给药量极小（ng-pg/ml): 检测灵敏度； 存在被测试药物的内源性物质：本底效应；同位素法; suppression via physiological regulation or feedback, eg, infusing glucose to suppress endogenous insulin 生物活性不仅取决于药物的一级结构,而且与其二级、三级结构有关：生物检定法；生物PD-PK模型,蛋白肽类药物样品检测方法,免疫测定法 (Immunoassays) 酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-link
13、ed immunosobant assay,ELISA); 放射免疫测定法 (Radioimmunoassay,RIA); 免疫放射定量法 (IRMA); 同位素标记示踪法 (Isotope label trace assay) 生物检定法 (Bioassays); 高效液相（HPLC）、液质联用（LC-MS）法: comparable sensitivity higher selectivity; eg, plasma bradykinin peptide antagonist; 毛细血管电泳(CE)、高效毛细血管电泳(HPCE) 和毛细血管电泳色普(CEC)； Real time PCR、
14、protein chips,ELISA法,一抗（种族特异性） 抗原（待测药物） 二抗（酶偶联） 显色酶底物 酶标仪,ELISA法,优点 高度的灵敏度: ngpg/ml; 较高的特异性; 易于操作、快速、不使用同位素、无辐射源,适用于批处理; 试剂使用寿命长； 目前最常用的检测方法。,缺点 待测蛋白多肽的免疫活性而非生物活性; 不能区别具有抗原决定族的代谢物片断； 不能同时测定代谢物片断; 不同来源抗体结合性不一； 受一些因素的干扰,ELISA法的干扰因素,具有抗原决定族的代谢物片断； 被测试药物的内源性物质； 基质效应; 被测试药物的可溶性受体 结合蛋白; 低亲活力结合蛋白 高亲活力结合蛋白
15、反复给药产生抗被测试药物的抗体：中和性或非中和性 长期给药； 生物等量性实验,Immunogenicity of native ADI and ADI-SS PEG in mice and rabbits,SC生长激素（0.4 IU/kg）后食蟹猴(n=7-8/组)的血清生长激素浓度,普通ELISA 、高灵敏度ELISA（additional 增色放大系统）和化学发光ELISA 法(luminol/过氧化氢底物)灵敏度和线性范围比较 (From 汤仲明，2002）,放射免疫测定法和免疫放射定量法,抗原，标记抗原，抗体 灵敏度高，尤其免疫放射定量法 需同位素 常用于激素浓度测定,同位素标记示踪法
16、,在目标蛋白多肽分子上标记同位素,从而鉴别目标蛋白多肽与内源性蛋白多肽 该法需将目标蛋白多肽进行同位素标记,标记方法有外标法(化学联接法) 和内标法(掺入法) 2 种； 外标法：将标记物如125 I 通过化学方法偶联至完整蛋白中如蛋白中酪氨酸或赖氨酸等，常用的化学方法有氯胺T 或Iodogen法 内标法：可用即将标记以3H ,14C 或35S 等同位素的氨基酸加入生长细胞或合成体系中,从而获得含同位素的蛋白多肽分子,但因其操作复杂而少用； 标记后蛋白多肽表征： 比放射性 放射性纯度 标记的蛋白多肽的生物活性。,同位素标记示踪法,优点 灵敏度高 简便直观 检测迅速 尤其适用于蛋白肽类药物的组织分
17、布,缺点 同位素标记 一般不能进行人体药物动力学研究; 可能引起药物的生物活性及代谢行为发生变化； 由于蛋白多肽进入体内会被降解代谢,或标记氨基酸的生物再利用，或与其它蛋白质结合,总的放射性不能代表药物动力学过程,同位素标记示踪法与其他分析手段联合应用,SDS-PAGE 三氯醋酸(TCA) 沉淀法 HPLC 法,生物检定法,利用被测蛋白多肽类药物某种特异生物反应,通过剂量(浓度)效应曲线对目标蛋白多肽进行定量测定的一种分析方法； 分为离体分析法和在体分析法； 离体分析法通常采用细胞体外培养技术,以细胞的增殖、分化或细胞毒性为基础,以细胞数目的增减等为量效指标，如水蛭素(hirudin) 凝血酶时间测定； 在体分析法则利用蛋白多肽类药物在整体动物中引起的特异生物学反应，如胰岛素降底小鼠血糖。,
