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1、第五章 基因与载体的连接,一、概述 二、粘性末端连接法 三、平端连接法 四、人工接头连接法 五、同聚物加尾连接法,2018/9/29,1,一、概述 1、DNA体外重组： 将目的DNA、载体DNA 和DNA连接酶在试管中进行的实验操作过程。,2018/9/29,2,2、DNA体外重组的特点： DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率。 由于限制性内切酶产生的粘性末端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离。 连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。,2018
2、/9/29,3,3、基因克隆： 是指将外源基因与有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA分子的过程，又称为分子克隆。 4、基因亚克隆： 是指将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的过程。,2018/9/29,4,5、载体DNA酶切位点具备的条件 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少，最好是单一酶切位点，这样能保证目的基因和载体DNA以最高的概率正确组合。 在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。 选择的载体必须在连接重组对基因转录和翻译过程中的编码区读框不改变。,2018/9/29,5,二、粘性末端连接
3、法 (1)单酶切位点的粘端连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接,2018/9/29,9,单酶切位点的粘性末端连接,2018/9/29,10,2018/9/29,11,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,2018/9/29,12,2018/9/29,13,如何防止载体自连呢,不同限制酶切位点（配伍末端）的连接,2018/9/29,14,2018/9/29,15,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,双酶切片段的定向克隆,定向克隆： 使外源DNA ( 目的基因 ) 片段定向插入到载体分子的克隆方案。,2018/9/29,1
4、6,定向克隆的优点： 外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒，以便目的基因的正确转录和表达。 质粒载体与外源DNA结合处的限制性内切酶位点仍然保留，可随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶切割后分离和获得目的基因。 由于不会发生自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的基因的重组质粒。,2018/9/29,17,定向克隆的连接方式： 外源DNA和载体DNA经过2个限制性内切酶切割后为非同源互补的粘端连接(粘端粘端连接)。 外源DNA和载体DNA经过2个限制性内切酶切割后一侧为二者互补的粘端，另一侧为平端或由非互补的粘端补平后产生的平端两者连接(粘端平端连接)。,2018/9/29
5、,18,2018/9/29,19,三、平端连接法 适用于限制性内切酶切割产生的平端 适用于粘端补齐或切平形成的平端,2018/9/29,20,2018/9/29,21,不同粘性末端变成平端连接,2018/9/29,22,当载体和外源DNA片段两端的酶切位点之间，不可能找到恰当的匹配时，解决方法：人工接头连接法：通过依次加入、连接合成DNA接头，再用限制酶切加以解决。 同聚物加尾连接法：可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源DNA片段的3端加上相互补的同聚尾加以解决。 PCR法：通过PCR(聚合酶链反应)技术扩增外源DNA片段，从而加上合适的限制性内切酶的单一识别序列，再用限制酶切加以解决
6、。,2018/9/29,23,四、人工接头(linker)连接法 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,2018/9/29,24,2018/9/29,26,人工接头连接,五、同聚物加尾连接法 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,2018/9/29,27,人工粘性末端的连接5突出末端,2018/9/29,28,2018/9/29,29,本章重点掌握的内容,概念： DNA体外重组、基因克隆、基因亚克隆、人工接头、定向克隆 DNA体外重组的特点。 载体DNA和目的基因DNA的连接方法。 定向克隆的优点及连接方式。 载体DNA酶切位点具备的条件 如何解决目的基因与载体的连接末端不匹配的连接？,2018/9/29,30,
