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1、第二十一章 药物制剂的微生物学检查,药物制剂的微生物学检查主要包括无菌检验，细菌总数测定，霉菌总数测定，以及病原菌的检验与螨的检测等。不同制剂的微生物学检验要求不完全相同。,第一节 无菌制剂的无菌检查,无菌检查是指检查药物制剂是否有活的微生物的一种方法。各种注射液（如针剂、输液）、手术及眼科制剂都必须保证绝对不含有任何活的微生物才视为合格，否则在临床使用时将会导致不良后果。,一、无菌检查的基本原则,基本原则：是采用严格的无菌操作方法，将被检查的药品取一定量分别接种于适合各种微生物生长的不同培养基中（通常为需氧菌培养基、厌氧菌培养基和真菌培养基），置适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，
2、以判断被检药品是否合格。由于无菌检查是用部分抽样结果推断整体的含菌情况，故被检样品的取样及程序必须按国家药典标准。,二、无菌检查的基本方法,（一）一般药品的无菌检查一般药品的无菌检查属于直接接种法，即将检品按规定量直接分别接种于适宜需氧菌、厌氧菌和真菌生长繁殖的一定量的培养基中，同时以同样培养基作阳性对照试验。阳性对照实验是证明微生物确实可在应用的实验条件下生长。,我国药典规定以金黄色葡萄球CMCC(B)26003、生孢梭状芽孢杆菌CMCC（B）64941、白假丝酵母菌CMCC（F）98001作为需氧菌、厌氧菌和真菌的阳性对照株。,然后按不同的需要条件培养一定时间，如需氧菌、厌氧菌在30-35
3、培养5天，真菌在20-25培养7天。观察结果时，阳性对照必须长菌，才能判定检品是否合格，若阳性对照管不长菌，说明该药物可能有抗菌作用、或是油剂等特殊制剂。检品如是液体，可直接加入培养基；若是固体药物，按规定加入一定量的无菌生理盐水或无菌水使药物溶解成均匀的检品溶液，然后进行无菌检查。,（二）特殊药品的无菌检查,如果阳性对照管不长菌，则必须进行特殊处理后方可按照一般药品的无菌检查进行。1、油类药物的无菌检查 一般油剂因与常规培养基不混溶，药品中的微生物不易生长，所以一般可采用吐温培养基，其余同一般药品无菌检查法。吐温培养基的特点是培养基中吐温80使油类药物均匀分散，增强培养基的机会，便于检出微生
4、物。,2、抗菌药物或含防腐剂药物的检查,如果被检药品具有抗菌作用，阳性对照管及实验管均可能不长菌，因此在进行无菌检查前必须采用方法除去药物本身的抗菌作用，然后再进行无菌检查。（1）加入灭活剂 或称对消剂，去除或抵消抗菌药物的抗菌作用。但灭活剂本身必须对微生物没有毒性，同时灭活剂与抗菌药物相互作用后的产物对微生物也没有毒性，灭活剂的作用必须迅速而完全。如青霉素在进行无菌检查时加入使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液。,（2）微孔滤膜法 被检药品先加入无菌生理盐水稀释，然后用无菌微孔滤膜器（孔径0.22-0.45m)过滤,用无菌生理盐水充分洗涤后,取出滤膜,分成若干片分别放入各种培养基中进行检查.,(3
5、)稀释法 先测出被检药品的最小抑菌浓度(MIC),然后将药品移种入大量培养基中,使药品稀释至不具有抑菌作用的浓度进行判定. (4)离心沉淀法 取规定量的供试液,离心(3000r/min),弃去上清夜,留底部浓缩菌液越2ml,再稀释成一定量进行检验.,第二节 口服药及外用药的微生物学检查,目前,对口服药及外用药的微生物学检验主要是微生物限量检验,即限制口服药及外用药的微生物总数和限制病原微生物种类的系列测定项目.我国规定的项目有:细菌总数测定,霉菌总数测定,病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和破伤风梭菌）的检验和活螨的检验。,判断合格与否的标准是：口服药及外用药中微生 物总量
6、须低于规定限量外，并须在口服药物每克或每毫升中不得含有大肠杆菌、沙门菌；,外用药物每克或每毫升中不得含有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌，此外均不得检出活螨。,一、细菌总数的测定,是了解被检药品在单位重量或体积（每克或每毫升）内所含有的活菌数（实际是需氧菌的活菌数），以判断供试药物被细菌污染的程度，是对该药品整个生产过程的卫生学总评的一个重要依据。,测定方法采用琼脂顷注平皿计数法,取一定量的供试药物以无菌生理盐水按比例进行系数稀释，加入定量的稀释液于无菌平皿中，再加入一定量的已融化的、温度在35左右的琼脂培养基混匀，凝固后，37培养24-48小时，记数平板内菌落。一般选取菌落数在30-
7、300之间的平板进行记数，然后乘以稀释倍数即可得到每克或每毫升供试药物中的活菌总数。,二、霉菌和酵母菌总数的测定,是考察供试药物中每克或每毫升所含的活霉菌和酵母菌的总数，以判明检品被真菌污染的程度。测定方法与细菌总数的测定方法相同，使用适合霉菌生长的虎红培养基。在25-28培养72小时，选取平皿中生长的菌落数在5-50个范围为宜，乘以稀释倍数，即可得单位重量（或体积）中的真菌总数。,三、病原菌的检验,病原菌检验的原则：病原菌的形态和培养特征的观察是鉴别的基本要求，对生化反应、血清学反应、动物毒力试验等项目的要求因菌而异。一般的检测程序为：药物的准备或预处理增菌培养分离培养纯培养染色镜检、生化试
8、验、血清学试验、动物试验等结果判断。,五类病原菌的鉴别意义和检验要点,1、大肠埃希菌 是口服药品的常规必检项目。药品的该菌来源于人和温血动物的粪便。凡由检品中检出该菌，表明药品可能被粪便污染，患者服用后，有被肠道致病菌和寄生虫感染的危险。因此，口服药品中不得检出大肠埃希菌 。,检验要点,（1）形态 ：革兰阴性短小无芽孢杆菌 （2）分离培养：在伊红美兰（EMB）培养基上分解乳糖，产生紫黑色、有金属光泽的菌落。 （3）生化反应： 乳糖发酵试验：产酸产气或产酸不产气；IMVIC试验：+-。,2、沙门菌,口服药物的必检项目，它主要寄生在人体和动物肠道内，可随粪便污染水源、食品和药品，能引起人类疾病，如
9、伤寒、副伤寒、急性肠胃炎及败血症等。因此规定口服药不得检出沙门菌。,检验要点：,（1）形态：革兰阴性短小杆菌（2）分离培养：SS琼脂上，沙门菌不分解乳糖，产生H2S，菌落无色、透明或半透明，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，菌落中心呈黑褐色。EMB平板上菌落呈无色或粉红色。三糖铁培养（TSI）上分解葡萄糖，可产酸产气，不分解乳糖、蔗糖，有动力、产生黑色沉淀。,（3）生化反应 ：沙门菌生化反应特性,葡萄糖 乳糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖+ - + + -吲哚 V-P 硫化氢 尿素酶 氰化钾- - +/- - -赖氨酸 动力+ +,（4）血清学反应,用可疑菌作为抗原，沙门菌A-F组的多价血清作为抗体进行玻
10、片凝集反应，并以生理盐水做对照试验。若出现凝集反应，表明该菌可能为沙门菌；若不出现凝集反应，则可将菌液于100水浴中煮沸30分钟后（目的是破坏菌体外H抗原）再行凝集反应，然后根据形态、菌落及生化反应结果综合判断。,表21-2沙门菌检查结果判断,血清凝集试验（A-F组抗“O”血清） 序号 凝集反应 10030分钟凝集反应阳性 2 阴性 阳性 3 阴性 阴性 0.9%氯化钠溶液对照 生化试验 结论判断阴性 符合 检出沙门菌阴性 符合 检出沙门菌不符合 未检出沙门菌,3、铜绿假单胞菌,是条件致病菌，特别在大面积烧伤、烫伤患者，眼科疾病和其他外伤后，常因感染该菌后病情加重，造成患者伤处化脓，严重的可引
11、起败血症，眼角膜溃疡甚至失明。因此，一般眼科制剂和外伤用药中不得检出此菌。,检验要点：,（1）形态： 革兰阴性短杆菌（2）分离培养：在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上菌落扁平，无定形，湿润，周边扩散或约有蔓延，灰白色，培养基上扩散有水溶性绿色色素。（3）生化反应 ：氧化酶试验阳性，绿脓菌素实验阳性，可报告检出此菌。若绿脓菌素实验阴性，则须明胶液化试验阳性，硝酸盐实验阳性，42生长试验阳性，才报告被检品有该菌。,4、金黄色葡萄球菌,是葡萄球菌属中致病力最强的一种菌，是人类食物中毒症的常见病原体，也可引起人体局部化脓感染，严重者可导致败血症。目前规定，凡眼科制剂和外用药不得检出该菌。,检验要点：,（1
12、）形态：革兰阳性球菌，葡萄状排列。（2）分离培养及生化试验 卵黄高盐培养基 甘露醇高盐培养基 菌落特征 金黄色，圆形突起 金黄色，圆形突起边缘整齐， 边缘整齐外围有乳浊圈 外围有黄色环 生化试验 甘露醇 血浆凝固酶+ +,5、破伤风杆菌,以植物的根、茎为原料的药品，常可受到破伤风梭菌的污染。如感染此菌后，可引起破伤风，死亡率在50%以上。因此，用于深部组织、创伤和溃疡面的外用制剂不得检出该菌。,检验要点：,（1）形态：革兰阳性芽孢梭菌，菌体细长，带芽孢的菌体呈鼓槌状，有周鞭毛，能运动，不形成荚膜。（2）分离培养：葡萄糖疱肉培养基，消化肉渣，使肉渣变黑，有特殊臭味。新霉素葡萄糖血平板上菌落蔓延生长，雾状、细丝状或羽毛状，边缘不整齐，常有溶血环。（3）毒力试验：小白鼠批下注射菌液，6-48小时观察发病情况。出现典型的破伤风病症，判定阳性。为证实小鼠是否破伤风外毒素引起，应同时做抗毒素保护试验，若不出现症状者为阳性，可判断被检品中检出该菌。,四、活螨的检验,螨是一种小形的节肢动物，可污染药物制剂，使之变质失效，并可直接危害人体健康，传染疾病，引起皮炎、过敏性疾患或消化道、泌尿道和呼吸道疾病。因此，口服药和外用药中均不得检出活螨。活螨的检查方法一般有：直接法、漂浮法和分离法三种，最后都在显微镜下观察有否活动的螨。,
