聚合酶链式反应技术

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1、实验二、 聚合酶链式反应技术,2011.10.29,一、实验目的,通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR) ：一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。,二、实验原理,PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。,基本反应步骤分三步：

2、1. 变性 (Denaturation)：加热使模板DNA在高温下变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。 2. 退火 (复性) (Annealling):使溶液温度降至50-60，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。,3. 延伸 (Extension):溶液反应温度升至72 ，以单链DNA为模板， 在DNA聚合酶的作用下、利用4种 dNTPs 等，以引物的 3 端开始，结合单核苷酸，按5 3 方向形成与模板链互补的新DNA链。上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2540个循环后DNA可扩增106 109 倍。,72,

3、94,55,PCR循环,费事、费力、易出错,早期的PCR技术,PCR的自动化：PCR仪,快速、简便,PCR技术的主要用途1、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个 细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊 断方面具有极广阔的应用前景。 4、DNA序列测定：PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化，也提高了测序的速度。

4、5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,三、试剂、材料和仪器,（1）材料： E.coli DH5 alpha（pUCCARNAi+X） 引物序列： NS4-zh-F:CCGCTCGAG ATGGCAAACTTATTCTT NS4-zh-R:GAAGATCT TCATTCTAGAACACCTTG （2）仪器 PCR仪（热循环仪） 制冰机 微型离心机 移液器,（3）试剂 模板DNA :用量需在实验中摸索。 Taq DNA聚合酶: 0.5 5 U / 100 l1U / 25 50lPCR缓冲液（ Tris- Cl，KCl，BSA） MgCl2：1.5 2.0 mM dNTPs ：0.02 0.2 mM 引物（Primer）：0.2 1 M 水：补足整个反应体积。,实验步骤 （一）PCR扩增目的基因X的部分片段（500bp）1. 在0.2mlPCR管内配制25ul反应体系。冰上进行。,2. 反应条件：PCR扩增仪上进行。 按下述程序进行扩增 Step1 94 3-5 min Step2 94 30s Step3 55 30s Step4 72 45s 2 35 Step5 72 10 min Step6 8 Forever 3、检测：琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果,思考题,引物设计的原则有哪些？如何对PCR进行优化？,