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1、亚慢性和慢性毒性试验,毒理学动物试验按染毒期限可分为四种，即急性、亚急性、亚慢性和慢性毒性试验，后三种可统称为重复染毒毒性试验。 急性毒性试验和慢性毒性试验分别代表了人一次染毒和长期反复染毒这两种暴露特征的毒性试验方法。 慢性毒性试验耗费大量的人力、物力和时间，亚急性、亚慢性毒性试验就具有预备或筛选试验的性质。,慢性毒性实验,由于人体接触外源化学物往往是长期、反复接触，利用急性毒性试验的资料难以预测慢性毒性。 外源化学物在长期重复染毒时可产生与急性毒性试验完全不同的毒作用。如苯急性中毒引起中枢神经系统抑制，而长期反复接触可引起粒细胞缺乏及白血病。,慢性毒性实验,随着动物的衰老，有些因素如组织易
2、感性改变、代谢和生理功能的改变，以及自发性疾病等均可影响毒作用的性质和程度。 某些重要的疾病例如心脏病、慢性肾衰、肿瘤等均与年龄的增长有关。,当外源化学物在亚急性、亚慢性毒性试验中有严重的毒作用时，此受试物就应考虑放弃，只有在必要时才进行慢性毒性试验。 Parkinson等(1995)报告117种药品狗亚慢性(90d)和慢性(24月)毒性试验结果与大鼠(短期或长期毒性试验)的结果比较，几乎没有发现新的毒性资料。因此，Parkinson等认为，动物毒性试验长于6个月没有必要，除非是研究致癌作用。,Weil等(1969)报告，112种受试物中，大鼠染毒90d后才出现毒性效应的只有3种(占2.5)，
3、其他受试物均在90d内已出现毒性效应，故认为大鼠90d毒性试验即可确定受试物的未观察到有害作用水平(NOAEL)。 尽管还有争论，亚慢性毒性试验(90d亚慢性试验)已成为比较常用的重复染毒毒性试验；从科学上和经济上考虑，慢性毒性试验就倾向于和致癌试验合并进行。,亚慢性、慢性毒性试验的概念,亚慢性毒性 (subchronic toxicity)指实验动物连续(通常13个月)重复染毒外源化学物所引起的毒性效应。 慢性毒性 (chronic toxiciy)指实验动物长期染毒外源化学物所引起的毒性效应。,亚慢性和慢性毒性试验目的,1. 确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱，对在急性及亚急性毒性试验中发
4、现的毒作用提供新的信息，并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用；2. 研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；3. 研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量-反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量(NOAEL)，提出此受试物的安全限量参考值；,4. 研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性；5. 亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据；6. 确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。,亚慢性和慢性毒性试验方法,1. 实验动物的选择2. 实验动物的染毒期限3. 染毒途径4. 试验分组和剂量设计
5、5. 观察指标,亚慢性和慢性毒性试验方法,1. 实验动物选择（品种、性别） 亚慢性和慢性毒性试验一般选择两种实验动物。一种是啮齿类，一种是非啮齿类，常用大鼠和狗。选择两种实验动物是为了降低外源化学物对不同物种动物的毒作用特点不同所造成的将实验结果外推到人的偏差。在亚慢性经皮毒性试验时，也可考虑用兔或脉鼠。 亚慢性和慢性试验选用雌雄两种性别，如某种药物临床上只用于一种性别，此时可选用单性别的动物。,2 染毒期限 慢性毒性试验要求使实验动物寿命的大部分时间染毒该受试物，因此在生命的早期开始染毒是很重要的，美国FDA要求啮齿类动物在研究开始时应小于6周龄。 同样的染毒期限对不同的试验动物，其意义不同
6、。一般地讲，慢性毒性试验对哺乳类应为两年的时间，对啮齿类相当于终生染毒，但对兔只相当于生命期的36，狗为20。,动物研究期限相当于寿命期()和人染毒的时间,慢性毒性实验的期限应依受试物的具体要求和实验动物的物种而定，工业毒理学要求6个月，环境毒理学和食品毒理学要求一年以上。如慢性毒性试验与致癌试验结合进行则染毒期限最好接近或等于动物的预期寿命。,3. 染毒途径外来化合物的染毒途径，应当尽量模拟人类接触受试化学物质的方式，并且亚慢性与慢性毒作用研究的染毒途径应当一致。 亚慢性和慢性毒性试验常用经胃肠道、呼吸道、皮肤染毒三种途径；药物临床前毒性试验中，动物染毒途径应尽可能与人的用药途径一致。,胃肠
7、道染毒,经胃肠道染毒毒物最好采用喂饲法，即将受试物与食物或饮水混匀，使实验动物自然摄入。 如果受试化学物质有异味或易水解时，也可以用灌胃方式染毒。 尽量减少实验人员及动物受污染的危险性 当用狗或猴进行长期实验时，不常采用喂饲染毒，因浪费量太大，通常采用胶囊或插胃管染毒。,呼吸道染毒,经呼吸道吸入染毒，每天吸入时期依实验要求而定，亚慢性毒性研究在工业毒理学可14h不等，环境毒理学可为46h。 在慢性毒性研究中，工业毒理学要求每天吸入46h，环境毒理学一般要求每天吸入8h。 凡需要在吸入期间喂食、喂水时，要注意防止受试化学物质污染食物、饮水及食具。,经皮染毒,经皮染毒的去毛部位面积一般不大于动物体
8、表总面积的10%15%，大鼠约为2050cm2，每次染毒46h，应防止动物舔食。 为保证受试物在动物体内浓度的稳定，每天应在相同的时间及实验室条件下染毒。每周至少染毒67d。,按预定剂量水平，吸入染毒气体和蒸气以mg/m3表示其浓度(mg/m3=（MWppm）/22.4)，掺入饲料或饮水以或ppm(mg/kg，mg/L)表示其浓度。,每周或每两周调整饲料中受试物的浓度以维持恒定的剂量水平，因为单位体重的饲料消耗量随动物年龄的增长而下降。如在啮齿类试验中，从离乳到成年过程中饲料中受试物浓度保持恒定不变，则在整个实验过程中的染毒剂量约减少至40。这可影响毒性反应的严重程度，并可能作出有耐受性的错误
9、判断。,4. 试验分组和剂量设计 在亚慢性和慢性毒性试验中，为了要得出明确的剂量-反应关系，一般至少应设3个剂量组和1个阴性(溶剂)对照组。高剂量组应能引起较为明显的毒性，中剂量组应该为观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)，低剂量组应相当于未观察到有害作用剂量(NOAEL)。,亚慢性毒性试验高剂量的选择，可以参考两个数值，一种是以急性毒性的阈剂量为该受试物的亚慢性毒作用的最高剂量，另一种是取受试物LD50的1/201/5为最高剂量。高、中、低3个剂量间组距以310倍为宜，最低不小于2倍。 慢性毒性试验剂量选择，高剂量可以选择亚慢性毒效应的NOAEL或其1/51/2为慢性毒性研究的最高剂量；各
10、剂量组间距以差25倍为宜，最低不小于2倍。,慢性毒性试验剂量间距应小于亚慢性毒性试验。 剂量选择的一般步骤是从急性(单剂量)毒性试验14天毒性试验90天毒性试验的程序，直接从急性毒性资料来确定慢性毒性试验的剂量经常有困难，可能高估或低估受试物的慢性毒性。如对剂量选择没有把握，则可在某项试验中多设几个剂量组，这比重复整个试验费用低得多。 如有性别差异，不同性别可选择不同的剂量。,对于药物而言，可用人拟用剂量的倍数来设计试验剂量，亚慢性毒性试验大鼠可用人拟用剂量10、30和100倍，非啮齿类可用5、15、50倍；慢性毒性试验大鼠可用人拟用剂量5、15和50倍，非啮齿类可用3、9、30倍。,ICH对
11、于药品慢性毒性和致癌性研究的最高剂量已取得一致的意见，但对于农药、工业化学品、食品添加剂和其他非药用化学物试验剂量的选择还有争论。 美国ILSI风险科学研究所关于啮齿类慢性毒性试验剂量选择工作组，该工作组(1997)鼓励不再唯一依照MTD原则(MTD主要由体重和组织病理学来确定)，并提出选择最高剂量和较低剂量的5个原则。 根据毒理学原理，慢性毒性试验剂量选择应使慢性毒性试验的敏感性增加到最大程度。在合理的剂量范围内，提高剂量可能增加检测毒效应的能力。 在选择剂量时，应考虑适当的试验设计、作用机制及其他有关的资料。,中、低剂量的选择不应该仅按最高剂量的某个固定的比例，而应考虑毒作用的机制和模式、
12、毒动学、以及下述的其他因素。而且中、低剂量的选择应尽可能显示剂量反应曲线的形状，并且考虑人体的暴露水平。 选择剂量时应考虑之前进行的各项研究所评价的终点如组织病理学、毒动学、细胞增殖和凋亡、生理功能、临床化学、血液学和尿分析、器官重量、体重等。 应考虑理化因素、生物利用度、在饲料或饮水中的适口性等。,亚慢性毒性试验一般大鼠68周龄(体重80100g)，每组大鼠不少于20只；狗812月龄，每组68只，雌雄各半。 慢性毒性试验中动物的年龄应低于亚慢性毒性试验，大鼠应刚离乳，体重在5070克为宜，一般要求每组40只，雌雄各半。同时设置阴性对照组。以狗为实验动物时，每个剂量组应各8只或以上，雌雄各半。
13、 在12年的长期实验中，必须考虑某些意外事故，需增添额外的动物。如对照组大鼠在2年期间自然死亡可使动物数减少20。,Homburer(1983)主张对照组的动物数等于每个染毒组的动物数乘以染毒组组数的平方根，如每组40只大鼠，共4个染毒组，则对照组应有80只大鼠，即402只。 如果设计要求在染毒受试物期间处死一部分动物，进行某些指标动态观察(如病理组织学检查或某些脏器的生化检查)，则在试验开始时应相应增加实验动物数。,5 观察指标（一般指标、实验室检查、大体解剖）,(1) 一般性指标 在实验过程中，仔细观察动物的外观(体表通道和毛色等)，社会行为(躁动、冷漠、探究活动)，刺激性(好斗等)及对周
14、围环境、食物、水的兴趣，这些信息单独一项无太多意义，但结合起来就有可能揭示出未观察到毒性症状前的潜在毒性效应。,动物体重 该指标比较重要且比较敏感，反映了受试物对实验动物的生长发育及一般状态的影响。 与对照组处于相同的喂饲条件下，如果受试组动物体重增长比对照组低10%，可以认为是由受试化学物所引起的毒效应。如果各剂量组体重增长改变有剂量-反应关系，就可肯定是一种综合毒性效应。,一般在亚慢性毒性试验应每周测体重一次，对慢性毒性试验，最初13周每周测体重一次，以后如动物健康状况无明显改变可每2周或每月测体重一次。 对各剂量组和对照组动物同期体重的统计和比较可有多种方式，可以用体重直接统计，也可用体
15、重的增长重量，或用体重百分增长率(以染毒开始时体重为100)，进行统计。,动物的饲料消耗 记录动物的饲料消耗，并计算食物利用率(实验动物每食入100克饲料所增长的体重克数)。 比较各染毒组与对照组实验动物的食物利用率，有助于分析受试物对实验动物的生物学效应。 食物利用率可用于鉴别啮齿类动物体重降低或增长减缓是由于受试物不适口，还是真正的毒作用。,(2) 实验室检查 在慢性毒性试验中，必须评价受试物对各器官系统的功能影响。血、尿等体液的实验室检查的目的是发现受试物所致的器官功能紊乱。最主要的是评价解毒和排泄器官(即肝和肾)，因为在这两个器官染毒受试物的浓度较高，另一个重要的靶器官是血液。 血液学
16、检查包括红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数及分类、血小板计数、凝血时间等。,临床化学指标与器官系统功能关系 心脏：肌酸激酶及其同工酶，乳酸脱氢酶(LDH)及其同工酶；肝：丙氨酸氨基转移酶(ALT)，白蛋白，碱性磷酸酶(ALP)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，-谷氨酰转肽酶(GGT)，LDH，山梨醇脱氢酶，总蛋白；肾：白蛋白，氯，肌酐(尿和血清)，葡萄糖，钾，蛋白(尿和血清)，钠，尿素氮；胰：淀粉酶，葡萄糖，脂酶，钙；骨：ALP，钙，磷，尿酸；其他：胆固醇(饲料和肝)，甘油三酯(饲料和肝)，高密度脂蛋白胆固醇，脂蛋白，葡萄糖，胆碱酯酶。 单个参数的变化很少有生物学意义，这些参数常常相互关联，应注意研究预期的参数变化谱。,实际操作中不影响实验动物生理功能的最大取血量为其总血量的10%；总血量约为50ml/kg，故0.3kg的大鼠约有15.0mL血液，一次取血量不应超过1.5mL。 尿液检查包括外观、pH值、蛋白、糖和沉淀物镜检等，可提供与毒物有关的中间代谢产物及靶器官毒性的证据。,
