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1、胶质瘤基因治疗的发展和现状 哈医大附属二院神经外科 杨 海 城,基因治疗的发展：,肿瘤基因治疗的实验研究始于80年代末。随着分子生物学技术的进步和肿瘤发病机制研究的深入基因治疗越来越受到重视，用于治疗肿瘤的基因靶点主要有: 组织相容性抗原,如HLA - B7 治疗直肠癌; 肿瘤抑制基因,如P16 治疗肺癌; 细胞因子,如用IL - 2治疗转移性的乳腺癌等。 同时对以病毒为载体转导自杀基因治疗神经胶质细胞瘤的研究拉开了胶质瘤基因治疗的序幕。,基因治疗的发展：,自从1992年,美国NIH批准第1个运用反转录病毒介导HSV2tk/ GCV 系统治疗脑胶质瘤的临床方案,全球掀起了肿瘤基因治疗的热潮。
2、这一时期，一些学者对抑瘤机制和基因的研究也取得一定的成果。如：自杀基因治疗、免疫基因治疗、抑癌基因治疗、抑制血管生成的基因治疗。,基因治疗的发展：,自杀基因 ：将它们转导至哺乳动物的细胞后，其表达产物将原先对细胞无毒或相对低毒的物质转变为细胞毒性物质，这种导致细胞“自杀”的基因称为“自杀基因”。目前研究最为广泛的是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-TK)基因以及肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD) 。,基因治疗的发展：,1992年,美国NIH小组Culver和Ram等把单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)基因导入逆转录病毒载体让其在“包装细胞”中复制包装，以产生具有感染性病毒粒子，将其注入胶质瘤内，
3、再给予GCV，取得了一定效果。 1994年Mullen等把CD基因转染瘤细胞随后给予5Fc，从而杀伤肿瘤细胞。,基因治疗的发展：,1996年2002年上海市神经外科研究所联合上海长征医院报告25例脑胶质细胞瘤用含单纯疮疹病毒胸昔激酶基因的逆转录病毒载体生产细胞(pLTKcSN/VPC)注人和经甲基无环鸟昔(GCV) 全身给药治疗脑胶质瘤2一5年随访观察( 失访1 例) 的结果。结果证实脑胶质瘤基因治疗的近期疗效要优于常规治疗疗效。,基因治疗的发展：,基因治疗的发展：,免疫基因治疗：包括将具有免疫刺激作用的细胞因子基因如白细胞介素类(IL-2、IL-4、IL-6、IL-7)、干扰素(IFN)、肿
4、瘤坏死因子(TNF-)粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等直接注入肿瘤内或体外转导入TIL或LAK细胞,通过抗肿瘤活性物质的表达增强其杀瘤作用。,基因治疗的发展：,1995年Sobol等应用反转录病毒载体将IL-2基因导入病人自身的胶质瘤细胞，此种培养细胞在经放射线照射后作为肿瘤疫苗反复接种于病人自身皮下，此种方案得到RAC（recombinant DNA advisory committee）的批准，结果病人经过10 次疫苗接种后，4个月后复查MRI，可观察到肿瘤明显缩小，末梢血中可查到CD8+T 淋巴细胞。 Bozik等提出将IL-4基因导入自身肿瘤细胞的治疗方案。,基因治疗的发
5、展：,抑癌基因治疗:原癌基因和抑癌基因都是正常细胞内存在的基因,它们在细胞的生长、分裂、分化和增殖中起着重要的作用。抑癌基因亦称为抗癌基因,是指正常细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。目前p53 基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,不少研究也证明肿瘤的生成会伴随p53 的缺失。近几年对于p53的研究也非常热门。,基因治疗的发展：,1994年Fujiqara等用逆转录病毒载体把野生型和突变型P53基因在体外转染胶质瘤细胞发现野生型P53能抑制瘤细胞生长 。 1997年Sandig 等利用腺病毒作载体同时转染p16 和p53 基因,对人肝细胞癌裸鼠动物模型进行基因治疗,结果能明显抑
6、制肿瘤的生长。,基因治疗的发展：,抑制血管生成的基因治疗:新生血管生成在实体肿瘤发展中的重要作用已被人们认识, 促血管生成因素与血管生成抑制物之间的平衡是新生血管是否形成的决定因素, 向肿瘤细胞转染血管生成抑制因子基因, 增加其在肿瘤局部的表达, 有利于使这种平衡向抑制血管生成的方面倾斜, 达到抑制肿瘤生长的目的。,基因治疗的发展：,用逆转录病毒或腺病毒转染血小板因子4（PF4） cDNA 后, 胶质瘤的内皮细胞DNA 合成降低40% 以上, 肿瘤血管减少, 生长受到抑制。 1999年Im 等利用腺病毒载体将血管内皮生长因子（VEGF） cDNA 分子转染到胶质瘤细胞中,重组腺病毒载体Ad5C
7、MV2alpha VEGF 携带野生型VEGF 165 cDNA 反义编码序列,恶性胶质瘤细胞被其感染后,检测到内源性VEGF mRNA 明显减少,相应的VEGF 蛋白也明显减少。将Ad5 CMV2alpha VEGF 注入到荷胶质瘤裸鼠体表的肿瘤中,明显抑制肿瘤的生长。,基因治疗的发展：,在此期间，病毒方法是应用最广的基因转移方法，常用的病毒载体有反转录病毒（RV）、腺病毒（AV）、腺病毒相关病毒（AVV）、单纯疱疹病毒（HSV）等 1998 年，日本学者夏日与美国学者合作，将腺病毒相关病毒AVV包装起来进行脑肿瘤动物模型基因治疗，获得显著效果AVV表达稳定性好，病毒无病原性，是当时较为理想
8、的载体,基因治疗的发展：,这一时期,随着免疫学的发展和对基因技术研究的不断加深,一些研究者结合病毒载体,转导自杀基因等方法在神经胶质瘤的治疗方面取得不少可喜成就,使基因治疗的作用进一步为人们所认识。但仍然存在许多问题。,基因治疗的发展：,1、各种各样的胶质瘤基因治疗的策略都有一定的局限性。如自杀基因治疗中GCV的毒性作用，血脑屏障的阻碍，各种基因在体内不能长期稳定表达等等 。,基因治疗的发展：,2、同时各种病毒载体也存在一定的局限性： 逆转录病毒(RV ) 载体: RV 滴度低, 难于纯化且不稳定, 不能转染处于静息期的肿瘤细胞群, 有插入突变的可能, 远离瘤床的肿瘤不能被病毒转染, 有神经毒
9、性等。 腺病毒(AV ) 载体：存在于染色体外, 被转染的细胞其子代细胞不再表达外源性基因。 腺相关病毒(AAV ) 载体: 每个载体颗粒的整合效率低, 外源基因插入容量小; 常整合的人类19 号染色体的重排与人类慢性B 细胞性白血病相关, 安全性尚需观察。,基因治疗的发展：,在经历了美国基因治疗副反应事件和法国“气泡儿童”事件后, 世界各国学者对基因治疗的态度更加谨慎。2 0 0 0年以后进入临床试验的方案逐年减少, 研究者更为关注基因治疗的安全性。特别是在1 9 9 9 年基因治疗临床试验中,出现首例运用腺病毒载体致人死亡的事件后人们把目光更多地转向了非病毒载体载体系统和联合基因治疗。,基
10、因治疗的发展：,2000年至今，已有许多联合基因治疗方法出现。如HSV-tk与IL-2或IL-4共同导入胶质瘤细胞制备肿瘤疫苗，HSV-tk与EC-CD共同转导入9L细胞联合治疗。联合应用HSV-tk和野生型P53两种基因治疗等，都取得了较好的效果。其中澳大利亚布里斯班皇家医院基因治疗中心 ，应用CDglyTK双自杀基因杀伤胶质瘤细胞取得良好效果。,基因治疗的发展：,2009年广东省东莞市人民医院神经外科联合山东大学齐鲁医院神经外科利用逆转录病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)融合基因转染小鼠C6实体胶质瘤，结果证实CDglyTK双自杀基因联合双前药治疗
11、能取得显著的抗胶质瘤作用。,基因治疗的发展：,基因治疗的发展：,近年来随着分子生物学及生物技术的快速发展。非病毒性载体发展迅速。主要有: 干细胞，阳离子聚合物、阳离子脂质体以及纳米微粒等。 目前, 临床试验中较常用的干细胞(骨髓间充质干细胞、神经干细胞)。具有高度的迁移性。对中枢神经系统病理性区域具有亲嗜性、多潜能性。它们弥补了病毒载体安全性低的缺点, 但转染效率却很低。,基因治疗的发展：,2010年青岛大学医学院附属医院神经外科构建骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的及效应。,基因治疗的发展：,基因治疗的发展：,基因治疗的发展：,神经干细胞同骨髓间充质干细胞一样，具
12、有肿瘤追踪和良好的基因修饰功能，同时神经干细胞有更好的分化功能，能更好的向神经细胞分化并具有神经系统修复功能，并分泌能直接作用于肿瘤细胞的细胞因子。是目前基因治疗神经系统肿瘤最好的载体。,基因治疗的发展：,2000年，Beneditti等首先将表达IL24的NSC用于治疗小鼠颅内胶质瘤,虽然治疗效果显著,但并未显示出NSC向迁移的胶质瘤的趋向性。,基因治疗的发展：,2002年，Ehtesham等将表达了IL212和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的NSC接种在荷GL16 的C57Bl/6 鼠和荷U343人脑胶质瘤的裸鼠颅内,结果显示NSC能追踪迁移的胶质瘤细胞,甚至可以跨越中线到有胶质瘤细胞的对侧。NSC分泌的细胞因子能有效的传输到原发肿瘤和肿瘤浸润、迁移的位置。,基因治疗的发展：,近年来 ，我院致力于研究将CD-TK融合基因转染神经干细胞进行移植研究，希望在一定程度上推进胶质瘤基因治疗研究，同时，为转基因神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病提供一定基础。为胶质瘤的治疗提供了一条有效地途径。,Thank you!,
