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1、植物细胞培养制药,意义药用植物是天然药物的宝库植物细胞培养是生产的药物可能途径 目前采用植物细胞培养生产的药物主要包括（1）苷（甙）类：包括皂苷（人参皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、强心苷（强心醇苷、毛地黄毒配质衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。（2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆甾醇、异岩藻甾醇等。,强心苷类（侧链为不饱和内酯环）,甾醇,（3）生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。 （4）醌类：包括蒽醌、萘醌等。 （5）蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。 （6）黄酮类：具有C6-C3-C6结构，生物合成前体是苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。多为治理心血
2、管疾病和高血压的药物成分。,小檗碱,蒽醌,黄酮,植物细胞培养制药进展,第一个专利： 1956年Routin和Nickell首次数提出利用植物细胞培养技术生产天然产物的第一个专利 工业植物生物技术 ：20世纪90年代明确提出 已经从 200余种药用植物获得了愈伤组织或细胞悬浮培养物（傅经国等，2004） 国际 日本 ：紫草 人参 红豆杉 欧美 ：美国红豆杉； 德国紫锥菊 国内：罗士韦 叶和春 郑光植 侯嵩生 丁家宜,技术路线,目标植物选择 愈伤组织诱导液体培养培养条件的优化反应器扩大培养 愈伤组织诱导固体、液体培养高产细胞系筛选生物合成途径的研究 器官分化（发状根）固体液体培养条件的优化反应器扩
3、大培养有效成分提取、分离,植物细胞培养,是指在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养增殖，获得大量细胞的一种技术。,植物细胞培养的特点:,大小; 细胞团的形式存在; 纤维素细胞壁和大液泡,易被剪切力损伤; 生长缓慢 培养基成分丰富而复杂,易被微生物污染; 需光氧二氧化碳,培养类型,按培养对象来说，可分为原生质体培养和单细胞培养； 按培养基类型可分为固体培养和液体培养； 按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养 。,植物单细胞分离和初步培养,单细胞获得： 机械法；酶解法；愈伤组织法 单细胞培养： 看护培养法（nursing
4、 culture) 饲养层培养(feeding layer culture),固体培养,固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加热溶解后，分别装人培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。 优缺点 简便易行、所占空间小 生长的不平衡，易出现了极化现象 易堆积生长过程中排出的有害物质 有些生理生化指标测定不方便 常用的固化剂 琼脂、明胶（10%）等,液体培养,1成批培养法 batch culture 细胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反应器内进行培养,在培养过程中培养液体积不变,不添加营养成分,待细胞增长和产物积累到适当的时间,一次性收获细胞产物和培养液的培养方法.,液体培养,1成批培养法
5、 batch culture 特点： 操作简单，培养周期短. 直接反映细胞生长代谢过程. 可直接放大 不能控制底物浓度细胞易老化生长周期短效率低. 两步成批培养法 即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。,2. 半连续培养法 semi-continuous culture 重复分批式培养或换液培养.在细胞增长和产物形成过程中,每间隔一段时间从中取出部分培养液或细胞,剩余的细胞作为种子,再用新的培养液补足到原体积,使生物反应器内的总体积不变. 特点: 细胞可持续指数生长,并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平,培养过程中可延续很长时间. 可进行多
6、次收获. 操作简便,生产效率高.,3连续培养法(continuous culture),连续培养法是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。 该法的理论基础是根据Monod公式，即生长速度取决于基质的浓度。maxS/(Ks+S) =特定生长速度； max=特定最大生长速度；Ks=饱和系数；S=基质浓度 两阶段连续培养法 于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该培养基，而于第二反应器中投入生产培养基。,3连续培养法(continuous culture),特点: 细胞能在近似恒定状态下生长、营养
7、物质浓度、产物浓度、pH基本保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可基本维持不变，细胞维持持续指数增长。 稳定状态可有效地延长分批培养中的对数生长期。,3连续培养法(continuous culture),问题: 一直有细胞收获，浓度一般不高 细胞分裂快、易变异； 由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染 对设备、仪器的控制技术要求较高。,悬浮培养（Suspension culture）,悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。特点 1. 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。2. 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相
8、对保持一致。,细胞悬浮培养的建立,愈伤组织的诱导,悬浮系的建立与继代培养,悬浮细胞的生长动态,悬浮细胞同步化,愈伤组织的诱导,选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。 选择适宜的培养基：较高激素浓度；必要的附加物质。,要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎,悬浮系的建立与培养,callus,150250ml flask,centrifuge isolation,subculture,1g/10ml medium,100120 rmp culture transfer 1 time/3d,80 rpm,成功的悬浮细胞培养体系特征,悬浮培养分
9、散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天便可增加一倍。,悬浮细胞的生长动态,悬浮细胞生长的衡量,根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。 生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养时间(t)的比值p(lnx-lnx0)/t 鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况 干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量,影响悬浮细胞生长的因素,起始愈伤组织的质量 接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度
10、一般在0.52.5105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。 培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。,影响悬浮细胞生长的因素,培养基 应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。 基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定 培养基设计时,一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基有MS、B5、LS 、N6等。 植物激素和其他附加成分的应用。,影响悬浮细胞生长的因素,培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养 温度 25 继代周期 指具
11、有一定起始密度的细胞,从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。 培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。 继代培养（Subculture）：继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。,悬浮培养细胞的同步化,细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。 通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。 什么措施？,细胞周期,饥饿法,饥饿导
12、致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。 氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞 磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化细胞。 将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。,抑制剂法,通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。 常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟基尿(HU)。 用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。 利用破坏微管的药物将细胞
13、阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。,分选法,依据：细胞体积大小 方法 常规分选方法是梯度离心 精细的分选可采用流式细胞仪 优点 操作简单 分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用 缺点 分选精细度较差,低温处理,可以提高培养体系中细胞同步化的程度 Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。 梅兴国等（2001）采用6低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。 可能的原因 不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。,单细胞
14、培养,意义 分离方法 机械法 酶解法 培养方法 平板培养 看护培养 微室培养 双层滤纸培养,单细胞分离方法,机械法 具体做法： 将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化 从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团 优点： 细胞不受酶伤害； 有利于进行细胞的生理和生化研究。,单细胞分离方法,酶解法 酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。 酶解法的优点 可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。,细胞平板培养（plating culture),指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养
15、基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5103个/毫升 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。,细胞平板培养（plating culture),平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数 植板率每个平板接种的细胞总数,细胞平板培养（plating culture),优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微
16、镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。,细胞悬浮,过滤,与培养基混合,植板,培养,克隆愈 伤组织,看护培养（nurse culture）,Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。 优点：简便易行，效果好。 缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。,微室培养(microchamber culture),在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。由Jones等在1960年设计的。 优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程 缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 细胞起始密度：3080个/室。,双层滤纸植板培养,Horsch等（1980）建立,
