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1、06:01:43,第六章 核磁共振波谱分析法,第一节 核磁共振基本原理,nuclear magnetic resonance spectroscopy; NMR,principles of nuclear magnetic resonance,06:01:43,核磁共振波谱学的发展,1946年，Purcell和Bloch观察到核磁共振现象。于1952年获得诺贝尔物理奖,06:01:43,1945-1951年间，化学位移和自旋偶合的发现，NMR技术的化学应用。1953年 世界上第一台商品化NMR谱仪.1964年 世界上第一台超导磁场的NMR谱仪1971年世界上第一台脉冲傅立叶变换NMR谱仪,06
2、:01:43,1976年R.R.Ernst发表了二维核磁共振的理论和实验的文章。获得1991年诺贝尔化学奖,06:01:43,1原子核的自旋:atomic nuclear spin,一.基本原理,如果放在外磁场中,原子核和电子一样, 存在自旋.从而有自旋角 动量()和磁矩,06:01:43,核的自旋角动量()是量子化的，不能任意取值，可用自旋量子数(I)来描述。,I0、1/2、1 h:普朗克常数,I = 0， =0， 无自旋，不能产生自旋角动量，不会产生共振信号。 只有当I O时，才能发生共振吸收,产生共振信号。,I 的取值可用下面关系判断：,06:01:43,06:01:43,2.自旋核在外
3、加磁场中的取向(旋转方向),取向数 = 2 I + 1 在没有外磁场时，自旋核的取向是任意的,并且自旋产生的磁场方向也是任意的.,如果把H核放在外磁场中,由于磁场间的相互作用, 氢核的磁场方向会发生变化:,如:H的I=1/2,则:,06:01:43,每一种取向都对映一个能级状态，有一个ms 。如：1H核：标记ms为1/2 和 +1/2,06:01:43,1,E2=+ m H0 E= E2 E1 = 2m H0 E1= m H0,自旋核在磁场中的行为,06:01:43,能级分布与弛豫过程,不同能级上分布的核数目可由Boltzmann 定律计算：,磁场强度2.3488 T；25C；1H 的共振频率
4、与分配比：,两能级上核数目差：1.610-5；,弛豫(relaxtion)高能态的核以非辐射的方式回到低能态。,饱和(saturated)低能态的核等于高能态的核。,06:01:43,讨论:,共振条件： 0 = H0 / (2 ) （1）对于同一种核 ，磁旋比 为定值， H0变，射频频率变。 （2）不同原子核，磁旋比 不同，产生共振的条件不同，需要的磁场强度H0和射频频率不同。（3） 固定H0 ，改变（扫频） ，不同原子核在不同频率处发生共振（图）。也可固定 ，改变H0 （扫场）。扫场方式应用较多。氢核（1H）： 1.409 T 共振频率 60 MHz2.305 T 共振频率 100 MHz磁
5、场强度H0的单位：1高斯（GS）=10-4 T（特拉斯）,06:01:43,氢核（1H）： 14092G 共振频率 60 MHz2.305 T 共振频率 100 MHz磁场强度H0的单位：1高斯（GS）=10-4 T（特拉斯）,06:01:43,讨论:,在1950年，Proctor等人研究发现：质子的共振频率与其结构（化学环境）有关。在高分辨率下，吸收峰产生化学位移和裂分，如右图所示。由有机化合物的核磁共振图，可获得质子所处化学环境的信息，进一步确定化合物结构。,06:01:43,四、核磁共振波谱仪 nuclear magnetic resonance spectrometer,1永久磁铁：提
6、供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。 2 射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。,06:01:43,核磁共振波谱仪,06:01:43,06:01:43,06:01:43,3 射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。,4样品管：外径5mm的玻璃管,测量过程中旋转, 磁场作用均匀。,06:01:43,NMR 谱仪,磁体,探头,机柜,RF 产生 RF 放大 信号检测 数据采集控制 数据信息交流 运行控制 磁体控制,前置放大器,计算机,数据储存; 数据处
7、理; 总体控制.,06:01:43,NMR 谱仪: 探头,RF 接口,RF 线圈 + 调谐元件 (电容器),Helmholtz,Solenoid,06:01:43,RF-Coil in NMR Probes,06:01:43,傅立叶变换核磁共振波谱仪,不是通过扫场或扫频产生共振；恒定磁场，施加全频脉冲，产生共振，采集产生的感应电流信号，经过傅立叶变换获得一般核磁共振谱图。 （类似于一台多道仪）,06:01:43,06:01:43,超导核磁共振波谱仪：,永久磁铁和电磁铁：磁场强度100 kG开始时，大电流一次性励磁后，闭合线圈，产生稳定的磁场，长年保持不变；温度升高，“失超”；重新励磁。超导核磁
8、共振波谱仪：200-400HMz；可 高达600-700HMz；,06:01:43,06:01:43,90年代末核磁共振波谱技术的新进展,高场超导核磁谱仪的使用900MHz800MHz,06:01:43,样品的制备：,试样浓度：5-10%；需要纯样品15-30 mg；傅立叶变换核磁共振波谱仪需要纯样品1 mg ； 标样浓度（四甲基硅烷 TMS） ： 1%； 溶剂：1H谱 四氯化碳，二硫化碳； 氘代溶剂：氯仿，丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物；,06:01:43,NMR图,06:01:43,1.化学位移:吸收峰所在的相对不同位置.在照射频率确定时，都是H核，所以吸收峰的位置应该是相同的,而实际不是这
9、样.,(1).化学位移的由来 屏蔽效应化学位移是由核外电子的屏蔽效应引起的。,06:01:43,H核在分子中是被价电子所包围的。因此，在外加磁场的同时，还有核外电子绕核旋转产生感应磁场H。如果感应磁场与外加磁场方向相反，则H核的实际感受到的磁场强度为：,式中：为屏蔽常数,核外电子对H核产生的这种作用，称为屏蔽效应(如果产生磁场与外加磁场同向,称之为去屏蔽效应)。,06:01:43,显然，核外电子云密度越大，屏蔽效应越强，要发 生共振吸收就势必增加外加磁场强度，共振信号将移向高场区；，共振信号将移向低场区。,06:01:43,(2). 化学位移的表示方法,化学位移的差别约为百万分之十，精确测量十
10、分困难，现采用相对数值。以四甲基硅（TMS）为标准物质，规定：它的化学位移为零，然后，根据其它吸收峰与零点的相对距离来确定它们的化学位移值。,06:01:43,为什么选用TMS(四甲基硅烷)作为标准物质?(1)屏蔽效应强，共振信号在高场区(值规定为0)，绝大多数吸收峰均出现在它的左边。(2)结构对称，是一个单峰。 (3)容易回收(b.p低)，与样品不反应、不缔合。,06:01:43,(3).影响化学位移(电子云密度)的因素:a.电负性:,元素的电负性，通过诱导效应，使H核的核外电子 云密度，屏蔽效应，共振信号低场。例如：,06:01:43,b磁各向异性效应：,A.双键碳上的质子,双键碳上的质子
11、位于键环流电子产生的感生磁场与外加磁场方向一致的区域（称为去屏蔽区），去屏蔽效应的结果，使双键碳上的质子的共振信号移向稍低的磁场区,=9.410 = 4.55.7,06:01:43,c.共轭效应 :电子云密度增加磁屏蔽增加,d.Van der waals 效应 :在空间中两个氢核靠 的很近时,核外电子会互相排斥,这时氢核电 子密度下降, 值变大.,06:01:43,第六节 核磁共振碳谱(13C)简介,有机化合物中C元素的重要性； 核磁共振碳谱与氢谱的差别 信号强度低： 13C丰度为1.1；磁旋比比1H小四倍； 为1H谱图的1/6000。 化学位移范围宽 0250(350)，有利于结构分析。 耦
12、合常数大 13C与直接相连的1H的耦合常数在125250Hz； 一般通过质子噪声去耦，得到单峰。,06:01:43,弛豫时间长 比1H慢； 可得到较多信息； 不能用于定量 共振方法多、信息多 质子噪声去耦、偏共振去耦、门控去耦。 谱图简单 一般为一级谱图。,06:01:43,06:01:43,06:01:43,第七节 二维核磁共振谱,二维谱是两个独立频率变量的信号函数S(1,2); 目前，主要是先得到以独立时间为变量的信号函数S(t1,t2)，再经过傅立叶转换成为两个独立频率变量的信号函数。,06:01:43,二维谱图的表示方法,06:01:43,二维谱图举例1,06:01:43,谱图举例2,
13、06:01:43,生物大分子空间结构的测定方法,X射线晶体学,多维核磁共振波谱学,06:01:43,06:01:43,核磁共振的特点,蛋白质处于溶液状态 适合研究蛋白质-蛋白质， 蛋白质-核酸，蛋白质-配基相互作用 可研究蛋白质分子内部运动 可研究膜蛋白,核磁共振基本原理 11讲 吴季辉,06:01:43,NMR structure of the recombinant murine prion protein,核磁共振基本原理 11讲 吴季辉,06:01:43,核磁技术和应用范围,06:01:43,蛋白质三维空间结构测定,样品制备 记录核磁共振谱 谱峰归属 确定二级结构单元 约束条件的建立
14、从NMR数据到分子模型,核磁共振基本原理 11讲 吴季辉,06:01:43,药物设计和筛选,06:01:43,06:01:43,hr-MAS of biological tissue,相同强度,放大,人前列腺组织（prostate tissu）良性 vs. 恶性,癌症组织给出更多的脂类物含量（lipid ）！,06:01:43,用NMR连续监测蛋白质复性过程,Stopped-flow 19F NMR spectra of the refolding of 6-19F-tryptophan labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase following dilution from 5.5 to 2.75 M urea at 5 C in the presence of 3.8 mM NADP+,
