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1、1,血栓与止血检测进展,王鸿利 上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海血液学研究所，200025,2,近年，随着基础理论和实验技术的发展，血栓和止血检验及其临床应用也有了很大的进展，本文就此作一简述。,3,（一）血小板微颗粒检测血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以伪足断裂方式形成直径为0.11.0m的血小板颗粒（Platelet Microparticle,PMP)。PMP的体积较正常血小板小，但有完整的血小板膜结构和功能。PMP膜上可表达多种血小板膜糖蛋白（GP）b/a（ GP b/a）、 GPb/-、血小板活化因子（PAF）、-样前体淀粉蛋白、Ca2+依赖性蛋白酶Calpainyi以及有促
2、凝作用的磷脂等。因此检测血循环中的PMP可较完整地反映血小板参与血栓形成和血液凝固的功能。,4,5,检测方法流式细胞术。主要试剂为CD61 parcp:多甲藻素-叶绿素蛋白标记抗血小板GPa的单克隆抗体参考值6617个/104血小板（山东大学齐鲁医院报道）。,6,临床意义PMP主要用于动脉血栓性疾病的检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标志物。1.急性冠脉综合征（ACS）：有证据显示，PMP参与动脉粥样硬化和血管再梗塞的病理过程。Cawaz等对急性心肌梗死（AMI）施行PTCA患者进行系列血小板功能研究，发现PTCA术后患者的血小板数因消耗增加而减少，PMP因大量形成而增多，后者又参与冠脉
3、血栓的形成。Katopodis等对行冠脉血栓形成术的ACS患者进行观察，他们将血小板激活状态作为试验组（近期发生AMI、不稳定性心绞痛者），结果发现，试验组患者PMP水平较正常对照组明显增高。,7,2.脑血栓形成：对大血管血栓、小血管血栓、多发性脑梗死和阿尔茨海默病患者进行PMP检测。结果发现，阿尔茨海默病患者的PMP水平与正常对照组无统计学差异，而其他疾病组患者的PMP水平均显著高于正常对照组，且治疗后有明显的降低，而且小血管血栓组患者的PMP水平高于大血管血栓组患者。表明PMP水平的增高，主要反映小动脉的血栓形成和血栓阻塞。,8,（二）血小板-白细胞聚集体检测血小板被激活后，血小板释放P-
4、选择素（P-selectin或GMP-140）。 P-选择素与白细胞和（或）单核细胞膜上的P-选择素配体糖蛋白-1（PSLG-1）结合形成血小板-白细胞聚集物（Platelet-Leucocyte Aggre -gate,PLA)和（或）血小板-单核细胞聚集物 （ Platelet-Monocyte Aggregate）。该聚集体是反映动脉血栓形成的特异性标志物之一。,9,检测方法流式细胞术。主要试剂为FTTC标记的鼠抗人GPIb（CD42b）单克隆抗体，藻红蛋白标记的抗人白细胞CD45单克隆抗体，FTTC标记的鼠抗人P-selectin （CD62b）单克隆抗体。参考值瑞典学者报道血小板-白
5、细胞聚集物为15.38.5（PLA/L）。,10,临床意义动物实验和临床研究表明，PLA是更敏感和更特异的血栓标志物。一组93例胸痛患者，其中9例为AMI患者，其血小板-单核细胞聚集物为34.210.3，84 例非AMI胸痛患者的血小板-单核细胞聚集体为19.31.4，二组差异显著（0.05）； AMI胸痛组和非AMI胸痛组患者的血小板-单核细胞聚集物水平均较10例正常对照组的血小板-单核细胞聚集物水平为高（0.001）。,11,（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）主要受vWF裂解蛋白酶
6、（ vWF C-leaving Proteinase, vWF -CP）的调节。vWF CP作用于 vWF分子量为250000多聚体的Try（842）-Met（843）之间的肽键，将它们水解成分子量为176000和140000的两个小分子肽段。此时vWF不能过度地参与血小板的粘附和聚集，因此vWF CP是限制血栓形成的标志物之一。,12,13,14,检测方法ELISA。以型胶原包被酶标板，2.5BSA封闭，分别加入未透析的标本和经Slide-A-Lyzer透析过的标本，一抗为兔抗人vWF多抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，加入底物OPD490nm显色。结果以透析前后的OPD490比值
7、作为该份标本的残余胶原结合活性（ vWF:CBA或R- CBA ）表示， R- CBA 越高， vWF-CP活性越低。参考值83例正常人血浆（n30） vWF:CBA 范围为2.140.5（21.99.2）；血清（n53） vWF:CBA范围为2.452.0（20.510.8）（苏州大学附一院）。,15,临床意义1.血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：由于患者的vWF-CP基因缺陷或患者血浆中存在抗vWF-CP自身抗体，使vWF-CP血浆水平显著降低，不能正常裂解超大分子量的vWF多聚体（UL- vWF ）。体内聚集的UL- vWF 易于血小板结合，促使血小板粘附和聚集，引起TTP病理过程的发生
8、和发展。一组5例TTP患者检测vWF:CBA结果为48.196.5（78.220.2），较正常对照组明显增高，反映患者vWF-CP明显降低。,16,2.血管性血友病（vWD）：据报道，21例vWF患者血浆vWF:CBA水平明显降于30例正常人、15例血友病患者及30例其他出血性疾病患者（0.001）。在vWF中，型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA比值1.0；型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA比值2.0；型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA都极低，其vWF:Ag/ vWF:CBA比值具有可变性。,17,3.恶性肿瘤：恶性肿瘤患者的vWF-CP活性水平显著低于正常人，伴有远处转移患者的v
9、WF-CP活性水平更低，接受手术治疗后患者的vWF-CP可升高，导致血浆大分子多聚体增多，促使vWF参与血小板粘附和聚集，加剧恶性肿瘤患者的高凝集状态和血栓形成，反映vWF是参与恶性肿瘤血栓形成机制之一。,18,(四)单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测 （monoclonal antibody specific immobili- zation of platelet antigen,MAIPA）将待测抗体、单抗和血小板共同温育，得到血小板膜GP、待测标本和单抗三分子复合物，然后加入酶联抗体并以微粒色被抗体固化于微孔中显色，显色深浅与待测抗体水平呈正比。参考值抗GP b/a阳性，A值0.133
10、；抗GPb阳性， A值0.209,19,20,临床意义检测血小板相关抗体，其敏感度和特异度高于双抗体夹心ELISA法。用于检测ITP和同种免疫血小板减少症。,21,两种方法对ITP诊断的比较,22,(五)凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）检测凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物（T-TM）将由肝脏合成的、分子量为55KD的凝血酶激活的纤溶抑制物（Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor,TAFI）的Arg（92）-Ala（93）之间的肽键水解后，脱去一个活化肽， TAFI变成活化型的TAFI a。 TAFI具有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性，但是TAF
11、I也受蛋白C抑制物（PCI）的抑制。,23,24,检测方法 采用 ELISA测定TAFI：Ag。以鼠抗人TAFI单克隆抗体包被酶标板，加入标准品或样品后，再加入辣根过氧化物酶标记的抗人TAFI抗体，充分作用后加入邻苯二胺使之显色，显色深浅与样本TAFI的含量成正比。 TAFI:A采用发色底物法测定。参考值 TAFI:Ag （n34）为7728 （21133）； TAFI:A （n34）为24 5g/L（1434g/L）（上海瑞金医院）,25,临床意义1.深静脉血栓（DVT）：Tiburg等对脑74例初发DVT患者的TAFI:Ag 进行检测，发现其水平增高。口服避孕药的正常生育期妇女，若TAFI
12、：Ag水平超过90，其水平的危险性水平2倍，此时患者的纤溶活性减低。2.动脉血栓（冠心病）：瑞金医院对19例冠心病患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现冠心病患者的TAFI:Ag和TAFI:A的水平均高于正常对照组（0.001），与Silveira报道11例冠心病的检测结果一致，表明患者的纤溶活性明显降低。此外， TAFI水平增高也见于不稳定性心绞痛。,26,3.微血栓（DIC）：瑞金医院对15例DIC患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现患者的水平明显低于正常对照组（0.001），表明患者纤溶活性明显升高。4.其他：TAFI水平升高还见于感染、因子V Leiden突变； TAFI
13、水平减低还见于某些凝血因子缺乏（血友病、F缺乏症）、急性早幼粒细胞白血病（ TAFI:A减低66，但TAFI:Ag正常）。,27,（六）可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（Soluble Endothelial Protein C Receptoe,sEPCR）是由血管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连EPCR，一部分流离于血浆称sEPCR。克隆的膜连EPCR cDNA全长1.3kb,是一种由221个氨基酸组成跨膜糖蛋白。膜连EPCR 通过促进T-TM复合物与蛋白C（PC）的结合，进而放大PC的活性；此外， EPCR还对体内急性炎症反应河DIC的发生具有保护作用。
14、然而，血浆中sEPCR与膜连的EPCR具有相反的作用。 sEPCR也可与PC和活化蛋白C（APC）结合。抑制PC的活化和抑制APC的抗凝活性，减轻膜连EPCR的增强PC活化和APC的抗凝作用，所以血浆sEPCR水平的增高市反映血管损伤和抗APC抗凝作用的特异性标志物。,28,检测方法采用 ELISA。以单克隆-抗包被酶标板，分别加入血浆标本和不同稀释度的sEPCR标准品后，以生物素标记的单克隆二抗作为检测抗体，加入底物后显色，绘制标准曲线。参考值血浆sEPCR为115.220.7g/L,29,临床意义安徽省立医院报道的结果见表1,30,（七）蛋白C Global试验凝血酶（T）与血管内皮细胞的
15、凝血酶调节蛋白（TM）形成复合物（T-TM），后者使PC转化为APC。 APC在蛋白S（PS）的辅助下，灭活因子Va和因子a，还抑制纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1），使纤溶活性增强。然而，Agkistrodon contorix蛇毒可以取代T-TM复合物直接激活PC，使PC转化为APC， APC也受PAI的抑制。,31,检测方法在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活PC，使PC转化为AP-C。随后在检测系统中加入APTT试剂以检测依赖PC活性的血浆凝固时间（Protein C Activ-Ity Dependent ClottingTime,PCAT）若待测血浆中的PC系统正常，则加入C
16、a2+后血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的影响，本试验设计了对照组，即在实验过程中以缓冲液代替PC激活剂，血浆不依赖PC活性的血浆凝固时（PCAT/O），其结果应短于60s。,32,参考值PCAT为85200s， PCAT/O为3355s （n234）。临床意义本试验对PC活性低于参考值70的检出率为90；对PS活性低于参考值的60的检出率为89；对凝血因子Leiden突变的检出率为100；对凝血酶原（F）20210 CA突变的检出率为84。本试验的检出特异性为79。因此，本试验多用于PC、PS、F Leiden突变和F20210 CA突变的检测，起到蛋白C系统筛选检测作用。但是，本试验也有假阳性，见于凝血因子、活性升高、口服抗凝剂和狼疮抗凝物质等。,
