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1、分子诊断技术在乙肝诊疗中的应用,艾迪康医学检验中心,低：北美、西欧、澳大利亚 中：东欧、地中海、日本、前苏联高：热带非洲、东南亚、中国,乙肝病毒结构,乙肝病毒DNA分子构造,pre-s1,S,P,C,c,X,HBV DNA 3.2 kb,HBV DNA为不完全闭合双链，分为长的负链和短的正链，其中在负链上有4个开放读码区（SCPX) S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAg,S,分子技术在乙肝诊断与治疗中应用,乙肝病毒感染自然史,HBV-DNA定性/定量分析,HBV DNA定性/定量分析,HBV基因分型,根据HBV全基因核苷酸序列的差异，将不同病毒株
2、分为不同基因型；目前HBV基因分型A.B.C.D.E.F.G.H共8个型不同的基因型具有不同地域分布我国主要是BC型为主北方C型,HBV不同基因型地域分布,基因型 * 地理分布A 西北欧、北美、非洲B 中国、东南亚C 中国、远东D 地中海区、印度、中东E 西非F 中南非、波利尼西亚G 法国、美国* 根据 HBV 全序列中核苷酸差异8% Chu CJ et al. Hepatology 2002; 35:1274 Hannoun C et al. JID 2002; 186:752Conjeevaram HS et al. J Hepatol 2003; 38:S90,HBV基因分型检测临床意义
3、,HBV基因分型,P区耐药位点检测,P区耐药位点检测,对病毒的抑制能力病毒变异需要突破的屏障用药习惯及治疗态度药物的化学结构,影响耐药发生的主要因素有哪些？,病毒的水平越低，耐药发生的几率越低,因素一：,因素二： 病毒变异需要突破的屏障 病毒发生耐药，需要突破药物的基因屏障，这些基因屏障就象是阻止病毒变异后攻城掠地的防御工事。不同的药物基因屏障高低不同。,基因屏障高的药物，耐药发生率低,低耐药屏障的药物 有些核苷类药物中只有1道抵抗病毒变异的屏障，因此，病毒容易突破屏障，耐药容易发生。,预防耐药，你需要更多重的保障,基因屏障高的药物，耐药发生率低,高耐药屏障的药物 高耐药屏障的药物有3道抵抗病
4、毒变异的屏障，病毒难以突破这3道屏障的重重保护，耐药发生的机率极低。,预防耐药，你需要更多重的保障,基因屏障高的药物，耐药发生率低,低耐药屏障的药物 拉米夫定、阿德福韦、替比夫定等药物，由于药物中只有1道抵抗病毒变异的屏障，因此，病毒容易突破屏障，耐药容易发生。 高耐药屏障的药物 而恩替卡韦由于药物中有3道抵抗病毒变异的屏障，病毒难以突破这3道屏障的重重保护，耐药发生的机率低。,耐药屏障耐药突变位点数,病毒耐药所需的足够突变,筛选出的其他突变位点,因素三：药物的化学结构所有核苷类药物都能引起HBV耐药，但不同化学结构的药物耐药发生率有很大区别。,核苷类药物的分类,L-核苷类似物：如拉米夫定、替
5、比夫定等无环碳磷酸盐化合物：如阿德福韦脱氧鸟苷类似物：如恩替卡韦,根据化学结构核苷类药物可分为三类，不同的类型的核苷类药物因其分子结构，具有不同的耐药特点,初治患者耐药发生率,拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦为基因型耐药发生率, 替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率,因素四：用药习惯及治疗态度（用药的依从性） 病毒耐药的发生跟患者的 用药习惯及治疗态度有很大的关系!一些患者:在服药时见好就收、吃吃停停，病毒不但没有彻底被抑制，反而更容易发生变异，从而助长了耐药的发生。一些患者:在发生耐药后，就对治疗失去信心，不再进行治疗，这将使耐药的后果更为严重。,耐药会导致哪些严重后果？,药物失效 病情恶化
6、产生多种药物耐药，给以后的治疗带来困难 治疗费用大大增加,使用高耐药的药物治疗发生耐药后，将出现严重的后果：,后果一： 药物失效 耐药发生后，原本有效的药物对病毒的抑制作用消失，导致HBV DNA水平、ALT水平等指标再次升高，病毒复制卷土重来。,后果二： 病情恶化 耐药致使病毒复制增加，肝脏损伤加重，病情恶化，可发展为肝硬化、肝癌等严重并发症，最终导致死亡的风险大大增加,后果三： 产生对多种药物耐药，给以后的治疗带来困难 耐药变异发生后，不但以前 使用的药物会失去作用，还会 使以后使用的其他药物疗效下 降，产生对多种药物的耐药。,多种药物耐药，给后续治疗带来严重困难,后果四： 治疗成本大大增
7、加 一旦耐药变异发生，原先有效的药物失效，换用或加用其它药物进行治疗时，往往需要加大使用剂量，将使治疗的成本大大增加,P区耐药位点检测,长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区耐药基因分析在临床药物选择上的应用目前最常见P区耐药位点11个 （169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、250）,拉米夫定对野生型HBV的抑制,拉米夫定,ss (-) DNA,抑制,HBV 聚合酶 (野生型),高亲和力,M,D,Y,D,Y = 酪氨酸 M = 蛋氨酸 D = 天门冬氨酸,拉米夫定和 YMDD 变异株,Y = 酪氨酸 V = 缬氨酸
8、D = 天门冬氨酸I =异亮氨酸,LAM 治疗基因型耐药的发生率,耐药发生率（%）,时间（年）,P区耐药病例分析,一名长期使用抗病毒药物拉米夫定治疗的病人，最近在日常HBV DNA检查中发现HBV拷贝数量有了很大升高，在换用替比呋啶后，情况仍然没有好转，如何处理？,拉米夫定 M204I/V L180M V173L恩曲他滨 V173L L180M M204I/V阿德福韦 A181V N236T恩替卡韦 T184A（G/I/S) M250V替比夫定 M204I/V,常用抗病毒药物的耐药位点,C区位点突变与病情发展的关系,-T-G-G-,HBeAg不能产生,影响血清学检查结果,-T-A-G-,C区突
9、变在B、C、D、E四种基因型更容易出现,C区常见位点突变,C区位点突变临床意义,治疗起 始点不同,干扰素治疗 疗程不同,治疗后的病 毒反跳以及 复发的情况,C区突变后 不推荐拉米夫定,C区突变者肝硬 化肝癌转变概率 建议肝组织活检,1、前 S1 变异株以前 S1 蛋白 C 端 AA 183 缺失突变较多见，这种突变因影响 HBsAg 正常分泌，并使 L 蛋白发生蓄积而引起肝细胞病变和肝细胞对炎性因子的损伤更敏感。 2、前 S1 基因起病密码下游 230 位核苷酸（nt 230）可因突变形成 终止密码并影响前 S2 起始密码，可使 HBV 逃避干扰素治疗和 宿主免疫清除。 3、前S2 变异导致S
10、2蛋白缺失，不能产生保护性抗体，HBV 逃避干扰素治疗和宿主免疫清除。 临床参考意义：与肝硬化，肝癌发生有一定关系,前S区变异,S区变异,145 GA (GR) 118 TL 120 PS 126 TI 143 TS 临床参考意义: 抗HBs识别HBsAg减弱, 肝炎疫苗失去免疫保护作用 S基因变异是疫苗免疫失败的重要原因 S 基因变异导致形成 HBsAg 阴性，抗 HBs 阳性，HBV-DNA 持续阳性的慢性乙型肝炎的重要原因,浅谈乙肝患者的生育问题,背景知识： 乙肝病毒对孕育有无影响？ 乙肝病毒感染对胎儿无致畸作用，也不引起先天性疾病 轻度肝炎对怀孕除早产率较高外，无其他影响 早期肝硬化如
11、代偿功能良好，对怀孕无明显影响 肝硬化代偿不全的孕妇可能发生急性肝衰竭，胎儿有早产、自发性流产和死胎的可能性 孕育对乙肝病情有无影响？ 怀孕对肝功能的影响很小，怀孕不会加重肝脏病变 怀孕时血容量扩张、血液稀释而白蛋白降低，球蛋白可以代偿性增高,治疗期间怀孕了怎么办,所有核苷类似物都没有做过致畸试验（也不允许做） 已知的是治疗丙型肝炎的核苷类似物病毒唑（又称利巴韦林）有明确的致畸作用 目前的检测手段B超或羊水检查，都很难查出胎儿是否存在畸形因此，治疗期间怀孕者需要夫妇双方共同协商，权衡利弊做出决策,慢性乙肝患者何时怀孕比较好,抗病毒治疗停药后6个月 经治疗肝脏病变稳定，反复检查肝功能转氨酶正常或
12、轻微异常，没有明显波动时 转氨酶较高者，可先用降酶药把转氨酶降下来，待肝功能稳定后停药再怀孕 如果患者符合05年乙肝防治指南中非活动性HBsAg携带的妇女最适合怀孕（非活动性HBsAg：ALT一年随访3次正常、HBV DNA检测不到，e抗原阴性）,怀孕前后应定期检测那些指标,在准备怀孕之前，必须综合评估，以选择合适的怀孕时机 血清转氨酶、乙肝三系、HBV DNA B超检查 必要时需要进行肝穿刺 孕中期需要监测肝功能、乙肝三系、HBV DNA（至少2月一次） 分娩前不仅要检查肝功能，还要检查凝血情况，必要时分娩后给予止血药物 分娩后需要定期检测肝功能、乙肝三系、HBV DNA，必要时给予抗病毒治
13、疗（至少6个月一次）,乙肝病毒母婴传染的途径,孕期通过胎盘感染 可能性5% 分娩过程感染 占绝大部分情况 产后哺乳期感染 乳汁感染、日常 生活接触,影响乙肝病毒感染性大小的因素：“乙型肝炎患者和携带者的传染性高低，主要取决于血液中HBV DNA 水平，而与血清ALT 、AST或胆红素水平无关”-2005年乙型肝炎防治指南阻断的问题：1. 按照目前采用的乙肝疫苗+乙肝免疫球蛋白联合母婴阻断，成功率在95%左右。2. 有部分医生采取在妊娠7.8.9月份注射乙肝免疫球蛋白的方法来降低母体内的病毒含量，但目前没有完全证明是安全有效的。,乙肝携带的妈妈可以哺乳吗,意见一：绝对不能意见二：完全可以意见三：
14、依妈妈体内的病毒情况而定，如果HBV DNA检测不到，可以哺乳。2005年指南意见：“新生儿在出生12 h 内注射HBIG 和乙型肝炎疫苗后，可接受HBsAg 阳性母亲的哺乳29 (III) ”,乙肝cccDNA,乙型肝炎病毒的复制过程,cccDNA存在于细胞核内，成为 乙肝病毒的复制池。目前尚没 有可以进入细胞核内，并能够 清除cccDNA的药物，这也是现 有抗病毒药物治疗效果不佳和 治疗后容易复发的原因。,肝脏以外的器官组织细胞可能 存在cccDNA，成为肝脏移植术 后乙肝复发的来源,为什么要关注cccDNA,抗病毒药物对cccDNA的影响,现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以
15、一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA 细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性,肝外组织也是cccDNA的储存池, 肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺、PBMC等组织或细胞中均检测到HBV的标志物,cccDNA检测的临床意义,第一，cccDNA可作为评价抗乙肝病毒药物的新指标。只有能够彻底清除HBVcccDNA的药物，才能算是真正“有效”的抗病毒药物 第二，检测HBVcccDNA可作为评价抗乙肝病毒是否能感染肝外组织的客观指标之一 第三，检测HBVcccDNA可评价乙肝患者病情和传染性大小,THANK YOU! 请提问和评论！ QUESTIONS? COMMENTS?,
