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1、1铁核结构对马脾铁蛋白释放铁动力学的影响铁核结构对马脾铁蛋白释放铁动力学的影响曾骥铁蛋白的主要生理功能是储存机体中过剩的铁及释放已储存的铁给需铁的细胞生物。此外,铁蛋白还能表达吸氢活性及从物理电极上接受电子等的新的生理功能。本文选用不同铁核结构为探针研究马脾铁蛋白(HSF)释放铁的动力学规律,为今后深入探讨铁蛋白的新生理功能提供有价值的理论研究依据。材料与方法材料与方法1 1、材料、材料HSF 蛋白浓度为 100mg/ml 并用 Sephadex G-25 层析柱(2X12 cm)纯化。经纯化的 HSF 在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈单条带。2 2、方法、方法（1）不同铁核结构的 HSF 释放铁速率
2、测定准确定量分析不同铁核结构 HSF 总的含铁量。以 HSF(pH6.5)总铁量为依据,根据实验所需释放的铁量和铁蛋白总的含铁量,定量加入Na2S2O4和 -联吡啶。用分光光度法(520 nm)测定 HSF 释放铁的速率。（2）外加磷酸盐对 HSF 释放铁速率的影响根据不同铁核结构的 HSF 总铁量,用 20mmol Na2HPO4配制外加磷酸盐量与 HSF 铁核中的含铁量比值范围在 0.001.20 之间。HSF 释放铁的速率和反应级数测定按作者的方法进行。表 1 不同铁核结构的 HSF 总的铁磷量及比值（PH5.09.0）pH5.06.07.08.09.0Pi/HSF28630834023
3、0170Fe3+/HSF11811701231618171700Fe3+/pi4.15.5 6.8 7.910.0（3）元素分析和不同铁核结构的 HSF 制备HSF 总的含铁量用分光光度法测定。磷量选用常规的 Cooper 方法测定。HSF 蛋白浓度是选用改良的 Lowry 方法测定。不同铁核结构的 HSF 制备的操作步骤如下：1）用 0.05mol/L NaOH调节 HSF 所需的 pH 值, 并稳定 2 小时。2）把不同 pH 值的样品分别加入 1.2X6cmSephadex G-25 层析柱并用相对应 pH 值的 Tris-HCl 缓冲剂洗脱 HSF 已释放的游离铁和磷酸盐。上述实验步2
4、骤均用高灵敏度的酸度计监测。不同铁核结构的 HSF 总的铁磷量及比值如表 1 所示。结果结果1、不同 pH 对 HSF 释放铁速率的影响表 1 的结果表明，随着反应介质 pH 递增或递减,HSF 均能直接释放一定量的酸碱不稳定铁,最终形成不同铁磷比结构的稳定铁核。HSF 释放铁的速率在酸性介质中明显大于在碱性介质中。总的平均释放铁的速率由原 135Fe3+/HSF/min (pH 6.5)逐渐递减 25.2Fe3+ /HSF/min(pH8.0),平均释放铁速率的递减率为 73.3Fe3+/HSF/pH。图 1 表示的结果是 HSF 释放铁的全过程。如把图 1 结果分别代入零级、1/2 级、
5、一级或二级的反应动力学方程时,其结果均无法获得一条以用纵座标表示释放铁的速率和横座标表示反应时间的直线。 因而可知,HSF 释放铁的动力学全过程呈复杂混合级反应。2、不同铁核结构对 HSF 释放铁核表层的铁的影响Na2S2O4是一种双电子供体,它以 1/2 级快速方式参与铁蛋白释放铁反应,其结果是铁核中Fe2+离子形成量与 Na2S2O4消耗量成对应的正比关系。 因而可推导如下动力学方程:HSF(Fe2+n)max-HSF(Fe2+m)t1/2=K(Tmax-Tt) 1HSF(Fe2+n)max表示 HSF 释放铁全过程总铁量。 Tmax是指 HSF 释放铁全过程所需的反应时间。3Tt 表示
6、HSF 释放一定铁量(mFe2+所需的反应时间。SF(Fe2+m)t表示在一定的反应时间内 HSF释放铁的含量。 K 表示 HSF 释放铁的速率常数。从表 1 和图 1 结果分析可知,反应体系 pH6.5(2600Fe3+/HSF)逐渐递增到 pH8.0(1871 Fe3+/HSF)时,HSF 直接释放占原铁核总铁量 28%的铁,并形成不同铁核结构。如果此时再进一步释放占铁核中总铁量 20%的铁,并把自各蛋白释放铁速率分别代入方程1,即可获得图 2 的结果。（Cmax: 每分子 HSF 释放最大的铁量； Ct : 在单位时间(Tt )内,HSF 释放的铁量；Tmax HSF 释放最大铁量所需的
7、时间）图 2 结果表明,同铁核结构的 HSF 分别释放占原铁核总铁量 20%铁时,其释放铁的速率明显不同。在酸性介质中,释放铁的速率高于在碱性介质中的速率,并均未出现释放铁速率的转折点和反应级数的转换。3、不同铁核结构对铁蛋白释放铁速率的影响当不同 HSF 铁核结构分别释放占原铁核总铁量 10%和 20%的铁时,并把所获得速率分别代入方程1,即可求出 HSF 释放铁的速率常数(K)。如用纵座标表示速率常数(K)和以横座标表示 pH作图时,即获得图 3 结果。根据图 3 结果分析可知;随着整体铁核结构中的铁磷比值递增，HSF释放铁的速率常数(K)逐渐降低,K 值递减率和 pH 值增加量的变化趋势
8、呈对应线性关系。 4、建立 H+参与 HSF 释放铁动力学方程根据 Harrison 提出铁蛋白释放铁的动力学模型、图 13 的结果，可认为当加入等量Na2S2O4和 -联吡啶时,不同铁核结构的 HSF 释放相同铁量的过程,可遵循如下反应:k1 k2HSF(Fe3+n)+ nH+ HSF(Fe3+n-m,Fe2+m)+ 1/2nH2OHSF(Fe3+n-m)+Na2S2O4 -dipyridylmFe2+-dipyridyl 2根据题意和方程2,即可得如下 H+参与 HSF 释放铁动力学方程:4dHSF(Fe3+n-m,Fe2+m)- =k3HSF(Fe3+n)H+n 3dtk3表示不同铁核结
9、构的 HSF 释放铁的速率常数。n 表示 H+参与 HSF 释放铁动力学反应级数。HSF(Fe3+n)表示 HSF 蛋白浓度。但当 HSF 参与释放铁反应时,只有 HSF 铁核中的铁浓度不断地减少,HSF 蛋白壳的浓度始终不变, 因而可认为HSF(Fe3+n)为常数,K3HSF(Fe3+n)可用 K 表示。根据上述方程、结果和条件,对方程3进行积分、简化后,可得如下动力学方程:pH2 kpH2N=-log- 3pH1 kpH1kpH1, kpH2分别表示相对应 pH 的 HSF 释放铁的速度常数。 把图 3 结果代入方程4,可获得N=1/2,则表明 H+以 1/2 级的方式参与 HSF 释放铁
10、核表层的铁。5、磷酸盐对 H+参与 HSF 释放铁的反应级数的影响外加磷酸盐能强烈地抑制 HSF 释放铁的速率,其抑制强度在酸性区明显高于在碱性区。然而，尽管外加磷酸盐能强烈抑制 HSF 释放铁的速率,但并不能转化 HSF 释放铁的反应级数。讨讨 论论铁蛋白释放铁的动力学性质均呈复杂化,其原因与铁蛋白的复杂铁结构有关。 虽然不同铁核结构、外加磷酸盐能直接影响 HSF 释放铁的速率,但并不能变反应级数(图 1-3）。这一现象说明了 HSF 所呈现的复杂动力学规律与复杂的铁核表层结构无关,可能与蛋白壳构象及调节能力有关。因而,使不同铁核结构的铁蛋白以不同的速率及相同的反应级数释放铁核表层的铁。根据
11、 Harrison 提出 HSF 释放铁的模型结构分析可知,Na2S2O4只能通过浓度扩散方式穿过铁蛋白蛋白壳隧道进入铁核中,并以 1/2 级的方式参与铁蛋白铁还原和释放。从表观现象分析可知： H+的作用是迫使 HSF 释放一定的铁量、构建不同的铁核结构及引起释放铁速率差异。但实际上,释放铁的速率的差异很可能是 H+直接作用于蛋白壳的隧道,使 HSF 适当地调节了隧道的宽度,加速了 Na2S2O4的扩散速率, 产生了 Na2S2O4的扩散速率与 H+浓度成对应的正比关系,引起了还原铁核中的 Fe3+速率递增,最终达到释放铁速率与 H+浓度成对应的正比关系。 因此,H+也和还原剂 Na2S2O4一样也以 1/2 级的方式参与铁蛋白释放铁的全过程。铁蛋白蛋白壳的自身调节能力对限制释放速率起着关键的作用并受环境因素强烈地影响。铁核表层的复杂磷铁结构对释放铁起着辅助性作用。 注：1、Na2S2O4（连二亚硫酸钠）：是一种双电子还原剂, 它能以 1/2 级反应方式参与固氮酶钼5铁蛋白中的铁硫簇及铁蛋白中铁簇的还原反应。 2、-联吡啶（别名：-dipyridyl）：白至浅红色结晶性粉末，易溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿和石油醚，微溶于水，用于检定亚铁、银。镉、钼，作为氧化还原指示剂。（作者单位：厦门市思明区园林公园管理中心）
