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1、基于单克隆抗体的多元弧菌免疫学检测技术的研究,2,Contents,副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3,3,第一章 研究背景及立论依据,1、形态：弧状或短杆状，有鞭毛 2、染色性：革兰氏阴性菌 3、培养特性：营养要求不高，嗜盐，在含有3.5%的NaCl培养基中生长良好，pH 7.0-9.5，TCBS培养基上易生长。 4、生化反应：氧化酶阳性，发酵葡萄糖、麦芽糖，不发酵乳糖、蔗糖；吲哚、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验均阳性。,1.1 弧菌生物学性状,4,第一章 研究背景及立论依据,1.2 研究背景及立论依据,弧菌,哈维氏弧菌,人畜共患病原菌,引起鱼体表出血性溃疡，食欲不振，严重时
2、鳞片脱落，烂鳍，眼内出血或变浑浊，肝肾等内脏出血，肠道发炎充血。也可感染虾和贝类。,鳗弧菌,溶藻弧菌,创伤弧菌,副溶血弧菌,引起人类胃肠炎、伤口感染和原发性败血症。,5,第一章 研究背景及立论依据,筛选、克隆、表达和纯化制备多元弧菌高同源性外膜蛋白,制备抗r-Omp多克隆抗体，并进行特性分析,取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞，进行细胞融合,筛选分泌抗多元弧菌单克隆抗体 的杂交瘤细胞株，体内法 生产单抗,建立基于单抗的多元 弧菌免疫学检测方法,免疫BALB/c小鼠,1.3 技术路线,6,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,外膜是革兰氏阴性菌细胞壁特有的结构，它位于细胞壁的最外层，厚81
3、0 nm，约占细胞壁干重的80%，通常由磷脂、若干种外膜蛋白(Omp)和脂多糖(LPS)组成。,2.1 革兰氏阴性菌外膜的结构,7,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,2.2 多元弧菌OmpK蛋白质序列比对,对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、3株哈维氏弧菌（Vh）和3株创伤弧菌（Vv）的OmpK蛋白质序列进行多重序列比对分析，在不同弧菌种内OmpK蛋白质序列的平均一致性（Identity）分别为：溶藻弧菌85%，副溶血弧菌78%，哈维氏弧菌78%，创伤弧菌85.3%。不同弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧
4、菌OmpK蛋白质序列的平均一致性分别为76.5%、81.6%、79.8%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpK蛋白质序列的平均一致性78.1%、72.5%；哈维氏弧菌与创伤弧菌OmpK蛋白质序列的平均一致性79.9%。,图2- 1 四种弧菌OmpK蛋白质序列比对图,8,2.3 多元弧菌OmpU蛋白质序列比对,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,通过对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、2株哈维氏弧菌（Vh）和3株创伤弧菌（Vv）的OmpU蛋白质序列比对分析发现，在不同弧菌种内OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为：溶藻弧菌
5、70.3%，副溶血弧菌96.5%，哈维氏弧菌85%，创伤弧菌89.3%。不同弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为75.7%、71.7%、67%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为82%、75.4%；哈维氏弧菌与创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性为70.8%。,图2- 2 四种弧菌OmpU蛋白质序列比对图,9,2.4 多元弧菌OmpW蛋白质序列比对,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、3株哈维氏弧菌（
6、Vh）的OmpW蛋白质序列比对分析发现，不同弧菌种内OmpW蛋白质序列的平均一致性分别为：溶藻弧菌96.0%，副溶血弧菌100%，哈维氏弧菌95.3%。不同种弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为93%、90.1%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列平均一致性为89%。,图2- 3 三种弧菌OmpW蛋白质序列比对图,10,2.5 三种蛋白在多元弧菌种内、种间的平均一致性比较（%）,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,综合比较多种弧菌种内、种间的三种外膜蛋白OmpK、OmpU和OmpW的序列一致性，OmpW蛋白质在溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧
7、菌种内的序列一致性高于其他两种外膜蛋白；而在不同弧菌种间，溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为93%、90.1%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列平均一致性为89%，均高于OmpK和OmpU在该三种弧菌种间的一致性。以上分析结果表明，OmpW是溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌三种弧菌的高度保守外膜蛋白，是作为三种弧菌的共同菌体表面抗原的较优选择。,11,2.6 与Vp RIMD 2210633的OmpW蛋白质序列的一致性较高的非弧菌,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,在NCBI网站中，使用protein blast程序，在NCBI nr Data
8、base中搜索与副溶血弧菌标准株Vibrio parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列的一致性较高的非弧菌菌株。,12,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,图2- 4 副溶血弧菌与大肠杆菌的OmpW蛋白质序列比对图 Query:V. parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct: E.coli IAI39的OmpW蛋白质序列,图2- 5 副溶血弧菌与痢疾志贺菌的OmpW蛋白质序列比对图 Query: V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct: C. Sh
9、igella dysenteriae Sd197的OmpW蛋白质序列,图2- 6 副溶血弧菌与嗜水气单胞菌的OmpW蛋白质序列比对图 Query: V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列； Sbjct: Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966的OmpW蛋白质序列；,图2- 7 副溶血弧菌与syringae假单胞菌的OmpW蛋白质序列比对图 Query: V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列； Sbjct: Pseudomonas syringae pv
10、. tomato NCPPB 1108的OmpW蛋白质序列,13,多元弧菌种内和种间OmpW蛋白质序列的高度保守性,弧菌和非弧菌OmpW蛋白质序列的较大差异性,单克隆抗体本身具有的识别单一抗原决定簇、特异性强的优良特性,为后续工作筛选到可特异性识别多元弧菌、而与非弧菌无交叉反应的抗OmpW单克隆抗体建立了理论基础,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,14,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,15,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3.2 ompW基因的克隆,图3- 1 副溶血弧菌目的基因ompW的PCR产物电泳图 1.DNA marker；2,3,4. Vp 1.1
11、997、Vp 86和Vp 87的ompW基因扩增产物.,以提取的副溶血弧菌Vp 1.1997，Vp 86，Vp 87基因组DNA为模板，分别扩增OmpW成熟蛋白的编码基因序列。将PCR产物分别上样1%琼脂糖凝胶，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察扩增后的产物，结果显示三株菌株对应的泳道均出现了约600bp的特异性扩增条带。,16,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3.3 重组质粒的构建及鉴定,图3- 2 重组质粒的PCR产物及双酶切产物电泳图 1.DNA marker; 2.重组pET28a-ompW质粒的PCR产物；3.重组pET28a-ompW质粒的双酶切产物；4. pET28a质
12、粒双酶切产物；5.DNA marker,3.3.1 重组质粒的PCR和双酶切验证:,分别双酶切pET28a载体和PCR产物，将二者进行酶连，连接产物转化感受态BL21(DE3)。提取重组菌的质粒经PCR反应后，扩增出约600bp的目的片段。提取的质粒经双酶切反应后，电泳图显示出现约5500bp和约600bp的目的片段；pET28a原始质粒双酶切后，仅出现约5500bp的片段。上述结果初步证实重组质粒已构建成功。,17,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3.3.2 重组质粒的测序鉴定:,图3- 3 副溶血弧菌Vp 1.1997与Vp RIMD 2210633 ompW基因序列的比对图
13、Query: Vp 1.1997的ompW基因序列；Sbjct: V. parahaemolyticus RIMD 221063的ompW基因序列,图3- 4 副溶血弧菌Vp 1.1997与Vp RIMD 2210633 OmpW成熟蛋白序列的比对图 Query: Vp 1.1997的OmpW成熟蛋白序列；Sbjct: V. parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW成熟蛋白序列,18,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3.4 重组蛋白r-OmpW的诱导表达与纯化,图3- 5 不同菌体裂解后产物的电泳图 1.蛋白marker; 2.含pET28a原始质粒且未经
14、IPTG诱导的菌体裂解产物; 3.含pET28a原始质粒且经IPTG诱导的菌体裂解产物;4.含pET28a-ompW重组质粒且未经IPTG诱导的菌体裂解产物; 5.含pET28a-ompW重组质粒且经IPTG诱导的菌体裂解产物.,图3- 6 重组蛋白的表达形式及纯化电泳图 1.protein marker; 2.重组菌裂解液离心后的沉淀；3. 重组菌裂解液离心后的上清液；4.纯化的重组蛋白,在IPTG诱导下，重组大肠杆菌大量表达出预期分子量(27kDa)的重组蛋白，重组蛋白以包涵体的形式存在。经镍柱Ni-IDA亲和层析法纯化，重组蛋白达到电泳纯。,19,第四章 抗OmpW多克隆抗体的制备与特性
15、分析,4.1 重组蛋白浓度测定,4.2 小鼠免疫及效价测定,以1 mg/mL BSA标准蛋白溶液稀释至不同浓度，分别加入考马斯亮蓝染液反应。根据标准蛋白BSA的含量与对应A595吸光度绘制Bradford标准曲线，得标准曲线方程为：y=0.045x（R2=0.976）。其中，y为595 nm处吸光度，x为蛋白含量。经透析后，重组蛋白浓度为0.636 mg/mL。,取纯化透析后的重组蛋白，对BALB/c小鼠进行免疫。三免后第7天断尾采血，分离血清。间接ELISA法测定血清中抗体效价，包被抗原为甲醛灭活的副溶血弧菌全菌。经测定，三免后抗体效价达到1:5.4104。抗重组蛋白血清识别副溶血弧菌全菌，
16、表明重组蛋白r-OmpW与天然蛋白OmpW具有相似的免疫反应性。,图4- 1 Bradford标准曲线,20,第四章 抗OmpW多克隆抗体的制备与特性分析,图4- 3 抗副溶血弧菌全菌血清与r-OmpW的 免疫印迹1.预染的蛋白marker；2.鼠抗副溶血弧菌血清与r-OmpW反应.,图4- 2 抗r-OmpW血清与r-OmpW的 免疫印迹 1.预染的蛋白marker；2.鼠抗r-OmpW血清与r-OmpW反应.,4.3 免疫印迹试验,重组蛋白r-OmpW具有良好的免疫原性,重组蛋白r-OmpW与天然蛋白OmpW具有相似的免疫反应性,21,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,图5-
17、1 单克隆抗体的制备过程,22,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,5.1 细胞融合与克隆化,图5- 2 杂交瘤细胞生长状态,将小鼠的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合后，重悬于HAT培养液，接种于5块96孔板。约8d后进行观察，有杂交瘤细胞生长的孔数为217孔，占45.2%；融合后第10d-12d，使用间接ELISA法对分泌单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞进行初筛，包被抗原为灭活的副溶血弧菌。其中阳性融合孔为24孔，阳性率为11.1 %。选择A值较大的三株阳性细胞株通过有限稀释法进行克隆化，直至克隆板阳性率达到100，建株保种。三株杂交瘤细胞分别命名为：S1E6，S4E10，S5C10。,
