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1、弘ISPR/Cas9系统及1其应用comtent口CRISPR-Cas系统简介日CRISPR-Cas系统的应用技术口CRISPR-Cas系统的应用前景1.CRISPR-Cas系统简丫11CRISPR-Cas系统的研究历史口1987年,日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列,随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中,2002年,正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列口2005年发现CRISPRK的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源,推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式拓抗外源遗传物质的入侵。口2007年,
2、Barransou等首伟发现组酯可能刊用CRSPR系统抵抗噱菌体入侵;2008年,Marraffini等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移,首次利用实验验证了CRISPR系统的功能口2013年初,MIT的研究组首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞BMXI和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞78基因实现了定点突变。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T细胞和K652细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口,从而激活细胞的DNA修复机制高效介导外源基因定点插入。p12CRISPR-Cas系统的结构口CiTSPR-CAS委等蒸锡戡者贾色掠s由不途续的曲界应刹eat
3、)与长度相似的名区庆刘5(spacers)间隔排晟的CRISPR篪,前导序列L(leader)以及一系列CRISPR相关蛋白基因cas。一一一一一一丁一一l了lII擅佚“助一E片刑H3闭限庞列protospacerAME1.3CRISPR-CAS系统的作用机理l.口CRISPR的高度可变的间隔区的获得雷Co的RRYAIA到CheptBezNewpeseerorCRISscqesidon国2CRISPR英描新间隔刑示恩国首先识别揩外源DNA潜的PALCNGG列,将近PAlI序frotOSacer;在CRJSPR基因座的5端合成重复序列后新列整合到两个重复序列间1.3CRISPR-CAS系统的作用
4、机理l.口CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熠加工)当该噬菌体再次入侵细菜时,CRISPR箱首先转录为长的crRNA前体,然后逐步被加工成小的成熟的cTRNA。口CRISPR/Cas系统活伯的发挥或者是对外源遗传物质的干扰cnfBA绪合相关的Cas|蛎自后,形成crRNA-Cas蛋白复合体,通过碱基互e补配对精确地与目标DNA相结合,随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。L仁一一学二-,srenoegvmapKR一ss_2-鹿人橘静/人hu乙|.】辱螂口olralpWA牛2卫EGEGEGEGE4EO54、2、CRISPR-Cas系统的应2.1CRISPR-Cas9介导的基因组精
5、确编辑的定五1nn。0刘泉逸基厂辑也因研木预D复改复峰蝶-悍口ZFNWTALEN畔CRISPR/Cas199620132011CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因迹行修饰的技术。Mali等人利用来自酿脓链球菌和嗜执链球菌中的c盯SPR相关蛋C己S9，/为重窒旦熹RNAsmal1u1deRNA)羞貂辑开羞的剪墨新莆霆通过可蕴吴吴洁R命继健描河畹】睹-镳_鳙-颤_鳙-镳罐_i蘑嗅chromosomephW23bpgenomictargetsequenceCWV88FNSceNyt入例子:基因敲除的实验过程1、在把基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列,与tracrRNA序列融合,设计出sgRNA并合成该序列。2、将该序列以及cas9袁因连入如图所磺载3、转化感受态,质粒小提,测序验证。4、细胞塘养与细胞转染5、敲除效果检测。6、建立稳定敲除的细胞株Cay林RRb_陟火发gg作
