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1、1、 采样和采集方法,为从特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。,实例： 自然界中细菌的分离,采样的注意事项,1、 采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的； 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦
2、采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长,1）土样采集方法,森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集； 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。,2）植物体采集方法,在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注
3、意不要损伤周围边缘。 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。,3）水样采集方法,用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。 方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4下贮存。,培养基的组成原则,1
4、）加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。 2）部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。 3）所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50gm1，以抑制真菌的生长。 4）琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育l、2天。 5）培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试 样的生态系统参数值相近。,2、富集方法,分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集 运用细菌的酶诱导性，在分离培养
5、基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。 富集可以促进抗性的产生并维持下来。,土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。 植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。 水中细菌的分离：水样通过0.22m无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。,3、次代培养及纯化步骤,1）涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。 2）用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。 3）筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。 4）将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。,
